5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對6種環(huán)境生物的急性毒性

游 泳， 林 濤， 李建宇， 史夢竹， 鄭麗禎， 傅建煒， 魏 輝

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福建 福州 350013

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(emamectin benzoate)，化學(xué)名稱4′-脫氧-4-表甲氨基阿維菌素B1苯甲酸鹽，是1984年美國Merk & C.公司(Demchak & Dybas,1997)對阿維菌素進(jìn)行衍生化合成，1994年又經(jīng)優(yōu)化改進(jìn)開發(fā)得到的半合成農(nóng)藥品種，是一種新型的抗生素類殺蟲劑、殺螨劑。甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽對小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(L.)、甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner、二化螟Chilosuppressalis(Walker)的活性高于阿維菌素(倪玨萍等,2003)，被廣泛用于防治蔬菜、果樹、水稻、棉花、茶葉等的害蟲(董利霞等,2012; 李建新等,2009; 李曉軍等,2009; 仇文法,2010; 楊海珍等,2001)。同時(shí)，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽開發(fā)出乳油、水分散粒劑、懸浮劑、微乳劑、水乳劑等劑型用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)(高忠文等,2006; 顧金祥和張驊,2001; 邵彥坡等,2012; 張林杰等,2011; 鄭彩華,2012)。但目前該農(nóng)藥的大量使用，不可避免地對環(huán)境生物帶來巨大的危害，可能會(huì)導(dǎo)致一系列的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。有關(guān)甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽對環(huán)境生物影響的研究很有限(蒼濤等,2007; 李賢賓等,2007； 魏方林等,2008; Willis & Ling,2003)。本文通過研究5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對6種環(huán)境生物的毒性，為該藥劑的安全合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

意大利蜜蜂ApismelliferaL.，購自福州市養(yǎng)蜂實(shí)驗(yàn)總場，在室外自行繁殖飼養(yǎng)。在人工氣候室內(nèi)飼養(yǎng)觀察24 h，選用大小一致、健康、活潑的蜜蜂用于試驗(yàn)，試驗(yàn)前饑餓2 h。

日本鵪鶉CoturnixjaponicaTemminck & Schlege，購自福州市閩侯縣南通養(yǎng)殖試驗(yàn)場。試驗(yàn)前在(25±2) ℃、通風(fēng)、透光的室內(nèi)環(huán)境下馴養(yǎng)7 d。挑選齡期為30 d、體質(zhì)量(100±10) g、健康、活潑的鵪鶉用于試驗(yàn)。

斑馬魚Daniorerio(F.Hamilton)，購自福州市花鳥市場，購回后馴養(yǎng)7 d再用于試驗(yàn)。每天喂食1次，試驗(yàn)前24 h停止喂食。試驗(yàn)時(shí)，斑馬魚體長(3.0±0.5) cm，體質(zhì)量(0.3±0.1) g。馴養(yǎng)水溫控制在(22±1) ℃，馴養(yǎng)所用自來水經(jīng)曝氣去氯氣處理24 h以上。

家蠶BombyxmoriL.，品種為“兩廣二號(hào)”，蠶種由廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站提供，保存于4 ℃恒溫冰箱中待用。在相對濕度為(75±5)%、溫度為(25±1) ℃、光周期L∶D=16∶8的人工氣候箱內(nèi)孵化，飼喂桑樹嫩葉至2齡供試。試驗(yàn)所用桑葉選用老熟葉片，洗凈晾干備用。

大型溞DaphniamagnaStraus，溞種引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，在本實(shí)驗(yàn)室自行保種繁育。在良好的培養(yǎng)條件下，使大型溞的繁殖處于孤雌生殖狀態(tài)。試驗(yàn)用溞為同一母體孤雌繁殖3代以上，出生時(shí)間6～24 h健康的幼溞。飼養(yǎng)所用自來水經(jīng)曝氣去氯氣處理24 h以上，pH 6.0～9.0，水質(zhì)硬度為140～250 mg·L-1(以碳酸鈣計(jì))，溶解氣4.0 mg·L-1以上。在自然光照下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度(20±2) ℃，每天喂食斜生柵藻。

蚯蚓，選用人工飼養(yǎng)的赤子愛勝蚓Eiseniafetida(Savigny)，蚓種購自廈門市興賢昆蟲養(yǎng)殖基地。在土溫為(23±3) ℃、相對濕度(80±10)%的土壤中，且飼養(yǎng)室內(nèi)24 h光照，馴養(yǎng)1個(gè)月以上供試。選擇出現(xiàn)生殖帶且體質(zhì)量為0.3～0.6 g的成蚓。試驗(yàn)用的人工土壤組成成分及配比參照蔡道基等(1989)和OECD(1984)。

1.2 供試藥劑

5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑為河北威遠(yuǎn)化工股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 對蜜蜂的毒性測定 采用急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)法測定。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，配制5組含不同藥劑濃度的染毒蔗糖水，藥劑濃度分別為0.1、1、10、100、200 mg·L-1，設(shè)空白對照。每個(gè)試驗(yàn)蜂籠放入10只蜜蜂，設(shè)3次重復(fù)。吸取10 mL含藥糖水注入裝有0.3 g脫脂棉的10 mL燒杯中，杯口向下倒置于試驗(yàn)蜂籠紗網(wǎng)上，供轉(zhuǎn)入蜜蜂自由攝食。分別在24和48 h觀察蜜蜂中毒及死亡情況。

1.3.2 對鳥類的毒性測定 采用急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)法測定。每組濃度測鵪鶉10只(雌、雄各5只，放在同一鳥籠中)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置5個(gè)濃度，分別為100、125、156、195、244 mg·kg-1，并設(shè)空白對照，不設(shè)重復(fù)。試驗(yàn)前禁食24 h，只供清水。將不同濃度的藥液按每100 g體質(zhì)量灌藥1.0 mL的方法進(jìn)行處理，然后按正常飼養(yǎng)方法進(jìn)行喂養(yǎng)。在溫度(25±2) ℃、濕度50%～70%、光周期L∶D=16∶8的飼養(yǎng)條件下連續(xù)7 d觀察受試鵪鶉的中毒癥狀和死亡數(shù)量。

1.3.3 對斑馬魚的毒性測定 采用靜態(tài)法測定。試驗(yàn)環(huán)境條件同馴養(yǎng)條件。在每個(gè)試驗(yàn)魚缸中分別配制5 L不同濃度的供試藥液，各試驗(yàn)魚缸分別投入斑馬魚10尾。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用曝氣自來水配制5個(gè)濃度的藥液，分別為0.60、0.50、0.45、0.40、0.30和0.20 mg·L-1，設(shè)空白對照，每個(gè)濃度處理設(shè)3次重復(fù)。每24 h測定各缸中藥液的溶解氧和pH值，觀察魚的中毒癥狀，及時(shí)清除死魚，記錄24、48、72、96 h的死亡數(shù)量。

1.3.4 對家蠶的毒性測定 采用浸葉試驗(yàn)法測定。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，配制5個(gè)濃度的藥液，分別為0.0031、0.0049、0.0078、0.0125、0.0200 mg·L-1，并設(shè)空白對照組。用不同濃度的藥液完全浸漬桑葉10 s，晾干后供家蠶食用。整個(gè)試驗(yàn)期間飼喂處理后的桑葉，觀察并記錄24、48、72、96 h的中毒癥狀和死亡數(shù)量。每個(gè)直徑9 cm培養(yǎng)皿中移入20頭家蠶，設(shè)3次重復(fù)。試驗(yàn)培養(yǎng)皿置于人工氣候箱內(nèi)，試驗(yàn)條件同飼養(yǎng)條件。

1.3.5 對大型溞的毒性測定 采用急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)方法測定。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用曝氣水分別配制濃度為0.01、0.1、1、10、100 mg·L-1的藥液，以曝氣水為空白對照。對照組和處理組均設(shè)4個(gè)重復(fù)。分別量取50 mL曝氣水或藥液到100 mL燒杯內(nèi)，每個(gè)燒杯中加入5頭幼溞，分別于試驗(yàn)開始后24、48 h觀察大型溞中毒癥狀和活動(dòng)受抑制情況。輕晃燒杯，幼溞在15 s內(nèi)不能游動(dòng)視為活動(dòng)受抑制。試驗(yàn)前和試驗(yàn)過程中測定每個(gè)濃度藥液的溶解氧、pH值和溫度，以確保其在試驗(yàn)所需范圍內(nèi)。

1.3.6 對蚯蚓的毒性測定 采用人工土壤法測定。將泥炭蘚、高嶺土、石英砂和碳酸鈣按質(zhì)量比10∶20∶68∶2混合均勻備用。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別配制含5個(gè)濃度藥液的土壤，濃度分別為0.1、1、10、100 mg·kg-1。在燒杯中放500 g上述人工土壤(標(biāo)本瓶中土壤厚度不低于8 cm)，加入用蒸餾水溶解后的藥劑，充分拌勻，再加入適量蒸餾水，調(diào)節(jié)土壤水分含量達(dá)30%左右。每個(gè)處理放入10條在未經(jīng)農(nóng)藥處理的人工土壤中馴養(yǎng)24 h的蚯蚓。用濕潤的紗布扎好瓶口，將燒杯置于(20±1) ℃、濕度80%～85%的培養(yǎng)箱中，400～800 lx光強(qiáng)連續(xù)光照。試驗(yàn)歷時(shí)2周，于第7天和第14天倒出燒杯內(nèi)土壤，觀察、記錄蚯蚓的中毒癥狀和死亡數(shù)量(用針輕觸蚯蚓尾部，蚯蚓無反應(yīng)則視為死亡)，及時(shí)清除死蚯蚓。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Excel 2007軟件統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)算甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽對意大利蜜蜂、日本鵪鶉、斑馬魚、家蠶、大型溞和赤子愛勝蚓的LC50(或LD50或EC50)及其95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對蜜蜂的急性毒性

接觸藥液后，蜜蜂表現(xiàn)煩躁不安，在蜂籠內(nèi)四處亂飛，嚴(yán)重的出現(xiàn)身體失去平衡、爬動(dòng)乏力、伸喙等中毒癥狀。

由表1可知，供試的5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對蜜蜂的48 hLC50為0.555 a.i.mg·L-1，95%置信限為0.436～0.725 a.i.mg·L-1。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對蜜蜂毒性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：48 hLC50≤0.5 a.i.mg·L-1為劇毒；0.5 a.i.mg·L-1<48 hLC50≤20 a.i.mg·L-1為高毒；20 a.i.mg·L-1<48 hLC50≤200 a.i.mg·L-1為中毒；48 hLC50>200 a.i.mg·L-1為低毒(國家環(huán)境保護(hù)總局南京環(huán)境科學(xué)研究所，1990)。由此判定，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對蜜蜂屬于高毒。

表1 5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對蜜蜂的急性毒性Table 1 Toxicity of emamectin benzoate on A.mellifera

2.2 5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對鵪鶉的急性毒性

鵪鶉經(jīng)口染毒后7 d內(nèi)出現(xiàn)迅速擊倒、蹬腿、抽搐、萎蔫、閉眼、發(fā)呆、羽毛蓬松、興奮、站立不穩(wěn)、抬頭無力、嘔吐、流涎等中毒癥狀。

由表2可知，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對鵪鶉的7 dLD50為148.369 a.i.mg·kg-1，95%置信限為129.231～169.497 a.i.mg·kg-1。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對鳥類急性經(jīng)口毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)：7 dLD50≤10 a.i.mg·kg-1為劇毒；10 a.i.mg·kg-1<7 dLD50≤50 a.i.mg·kg-1為高毒；50 a.i.mg·kg-1<7 dLD50≤500 a.i.mg·kg-1為中毒；7 dLD50>500 a.i.mg·kg-1為低毒(國家環(huán)境保護(hù)總局南京環(huán)境科學(xué)研究所，1990)。由此判定，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對鵪鶉急性經(jīng)口毒性屬中毒。

表2 5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對鵪鶉急性經(jīng)口毒性Table 2 Toxicity of emamectin benzoate on C.japonica

2.3 5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對斑馬魚的急性毒性

斑馬魚放入帶藥液魚缸后，出現(xiàn)側(cè)游、沉底、翻白、反應(yīng)緩慢、游動(dòng)加速等中毒癥狀。

由表3可知，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對斑馬魚的96 hLC50為0.368 a.i.mg·L-1，95%置信限為0.327～0.401 a.i.mg·L-1。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對魚類毒性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：96 hLC50≤0.1 a.i.mg·L-1為劇毒；0.1 a.i.mg·L-1<96 hLC50≤1.0 a.i.mg·L-1為高毒；1.0 a.i.mg·L-1<96 hLC50≤10 a.i.mg·L-1為中毒；96 hLC50>10 a.i.mg·L-1為低毒(國家環(huán)境保護(hù)總局南京環(huán)境科學(xué)研究所，1990)。由此判定，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對斑馬魚屬于高毒。

表3 5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對斑馬魚急性經(jīng)口毒性Table 3 Toxicity of emamectin benzoate on Danio rerio

2.4 5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對家蠶的急性毒性

家蠶染毒96 h內(nèi)，出現(xiàn)拒食、趨避、生長緩慢、亂爬、不能正常蛻皮、身體變軟、蜷縮、變黑、體液外滲、腐爛、晃頭、脫水、吐液等中毒癥狀。

由表4可知，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對家蠶的96 hLC50為0.005 a.i.mg·L-1，95%置信限為0.005～0.006 a.i.mg·L-1。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對家蠶毒性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：96 hLC50≤0.5 a.i.mg·L-1為劇毒；0.5 a.i.mg·L-1<96 hLC50≤20 a.i.mg·L-1為高毒；20 a.i.mg·L-1<96 hLC50≤200 a.i.mg·L-1為中毒；96 hLC50>200 a.i.mg·L-1為低毒(國家環(huán)境保護(hù)總局南京環(huán)境科學(xué)研究所，1990)。由此判定，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對家蠶為劇毒。

2.5 5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對大型溞的急性毒性

大型溞染毒后表現(xiàn)出沉底、打轉(zhuǎn)、抽搐、興奮、加速游動(dòng)等中毒癥狀。

由表5可知，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對大型溞的48 hEC50為0.020 a.i.mg·L-1，95%置信限為0.015～0.026 a.i.mg·L-1。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對大型溞毒性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：48 hEC50≤0.1 a.i.mg·L-1為劇毒；0.1 a.i.mg·L-1<48 hEC50≤1.0 a.i.mg·L-1為高毒；1.0 a.i.mg·L-1<48 hEC50≤10 a.i.mg·L-1為中毒；48 hEC50>10 a.i.mg·L-1為低毒(國家環(huán)境保護(hù)總局南京環(huán)境科學(xué)研究所，1990)。由此判定，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對大型溞的抑制毒性為劇毒。

表4 5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對家蠶急性攝入毒性Table 4 Toxicity of emamectin benzoate on B.mori

表5 5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對大型溞運(yùn)動(dòng)抑制毒性Table 5 Toxicity of emamectin benzoate on Daphnia magna

2.6 5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對蚯蚓的急性毒性

染毒后的蚯蚓表現(xiàn)出明顯的身體拉長、移動(dòng)緩慢、活力下降等中毒癥狀。

由表6可知，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對蚯蚓的14 dLC50為18.397 a.i.mg·kg-1，95%置信限為16.073～20.948 a.i.mg·kg-1。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對蚯蚓毒性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：14 dLC50≤0.1 a.i.mg·kg-1為劇毒；0.1 a.i.mg·kg-1<14 dLC50≤1.0 a.i.mg·kg-1為高毒；1.0 a.i.mg·kg-1<14 dLC50≤10 a.i.mg·kg-1為中毒；14 dLC50>10 a.i.mg·kg-1為低毒(國家環(huán)境保護(hù)總局南京環(huán)境科學(xué)研究所，1990)。由此判定，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對蚯蚓的急性毒性為低毒。

表6 5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對蚯蚓急性毒性Table 6 Toxicity of emamectin benzoate on E.fetida

3 討論

本研究表明，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對水生生物斑馬魚為高毒，對大型溞為劇毒。因此，要盡量避免使用5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑防治水稻害蟲，以避免其通過稻田水進(jìn)入水體，對水生生態(tài)系統(tǒng)造成破壞。

蜜蜂是最重要的傳粉昆蟲，占傳粉昆蟲總量的80%左右，由于蜜蜂對農(nóng)藥極為敏感，濫用或誤用農(nóng)藥都會(huì)對其造成不利影響(Chauzatetal.,2004)。本研究中，以意大利蜜蜂為對象測得5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對蜜蜂的急性經(jīng)口毒性為高毒。因此，在田間使用5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑時(shí)，應(yīng)避免在作物花期以及蜜蜂采粉區(qū)使用，以減少對蜜蜂的傷害。

家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲之一，對化學(xué)農(nóng)藥非常敏感，極易發(fā)生中毒。江蘇省2006年以來發(fā)生多次家蠶中毒事件，重要的原因就是桑葉受到農(nóng)藥的污染(朱紅,2013)。本研究表明，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對家蠶急性攝入毒性為劇毒，因此要避免在蠶桑區(qū)、采桑養(yǎng)蠶季節(jié)使用。若在桑園周邊使用5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑防治其他作物害蟲，注意設(shè)立隔離帶，避免在有風(fēng)的天氣施藥，以減少對桑園的污染。

鳥類是生態(tài)系統(tǒng)中重要的生物種群。通過直接噴藥在巢穴或鳥類身上，鳥類采食藥劑處理過的種子以及被農(nóng)藥污染的食物、水體，鳥類在使用農(nóng)藥不久的農(nóng)田上活動(dòng)等，不僅直接危害禽鳥類，而且可以通過生物鏈在其體內(nèi)蓄積(朱忠林等,2003)，間接對人類的健康造成潛在的危害。本試驗(yàn)通過急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，明確了5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對鵪鶉為中毒。有關(guān)甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對鵪鶉產(chǎn)蛋量、孵化率的影響還有待進(jìn)一步研究。

蚯蚓作為土壤無脊椎動(dòng)物的代表，在改善土壤透氣性、改善土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤肥力等方面有著重要作用(胡霞,2008)。同時(shí)，蚯蚓還是許多動(dòng)物的食物來源，影響著農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，在食物鏈中起著污染物傳遞的橋梁作用。因此，農(nóng)藥對蚯蚓的毒性，是評價(jià)農(nóng)藥對環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)安全性的重要指標(biāo)之一。本研究明確了5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑對蚯蚓的急性毒性為低毒。有關(guān)其亞致死劑量對蚯蚓的行為、生長發(fā)育和繁殖等的影響還需進(jìn)一步研究。同時(shí)，由于土壤環(huán)境中往往以多種農(nóng)藥形式存在，有必要開展甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑與其他藥劑的復(fù)合致毒研究，以更科學(xué)合理評價(jià)藥劑對蚯蚓的環(huán)境安全性。

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