互花米草黃酮含量分析及其生態(tài)學意義

劉金珂， 王天弘， 周長芳， 胡楚琦， 王涵興

南京大學生命科學院,江蘇 南京 210093

禾本科米草屬植物共有14個物種(包含部分雜交種)，其中在全球范圍內(nèi)形成入侵的物種有3個，包括互花米草SpartinaalternifloraLoisel、密花米草SpartinadensifloraBrongn(也譯作多花米草)以及大米草SpartinaanglicaC．E．Hubb．(Strong & Ayres，2013)。中國目前所涉及的2種米草屬植物均為引進種。其中，大米草于1963年引自英國和丹麥，20世紀80年代在中國沿海擴散面積達36000 hm2，后期因不明原因萎縮，目前分布面積不足50 hm2(Anetal.，2007)?；セ撞萦?979年底引自美國的北卡羅來納、佐治亞和佛羅里達州，目前國內(nèi)分布的米草屬植物主要為該物種，最新統(tǒng)計面積為34178 hm2(Lu & Zhang，2013)。

互花米草為多年生C4草本植物，原產(chǎn)于北美洲大西洋沿岸和墨西哥海灣，并已入侵至北美洲太平洋沿岸、澳大利亞、法國、英國和中國等國家和地區(qū)(鄧自發(fā)等，2006；Strong & Ayres，2009)?；セ撞萦?979年底引入中國，20世紀80～90年代在保灘護岸、促淤造陸方面發(fā)揮了顯著效果(Chungetal．，2004)。但近年來其在我國東南沿海潮間帶的迅速擴張也給當?shù)佧}沼生態(tài)系統(tǒng)帶來了顯著的負效應(Anetal．，2007)?；セ撞莸臄U散改變了潮間帶原有的地貌特征，并與蘆葦?shù)韧林参锔偁?，影響了底棲動物、土壤微生物等的多樣性，改變了鹽沼土壤碳、氮庫及硫的生物地球化學循環(huán)特征，進而影響了整個海濱濕地系統(tǒng)的生態(tài)功能(周長芳等，2009；Chenetal．，2008；Zhouetal．，2009)。鑒于此，有關(guān)互花米草擴張的機制和種群控制策略已成為當前全球生態(tài)學研究的熱點(Hedgeetal．，2003；Roberts & Pullin，2008)?；セ撞菀脖晃覈r(nóng)業(yè)部列為第一批重點管理的外來入侵物種之一(《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告》第1897號)。

黃酮類化合物是廣泛存在于植物體內(nèi)的一類次生代謝物。該物質(zhì)被認為是植物重要的抗氧化成分之一，可清除羥自由基等活性氧組分，并在植物光保護過程中發(fā)揮作用(Agatietal．，2013)。黃酮類成分在入侵植物的化感機制中也起著重要作用，例如Maetal.(2009)在入侵植物五爪金龍IpamoeacairicaL.中分離到2種黃酮類化合物3-3′-5-Trillydroxy-4′-7-dimethoxyflavone和3-3′-5-Trihydroxy-4′-7-dimethoxyflavone-3-O-sulfate，并發(fā)現(xiàn)這2類化合物能抑制蘿卜、黃瓜、白菜和黃帚橐吾等種子的萌發(fā)；郭亞姣等(2011)發(fā)現(xiàn)黃頂菊Flaveriabidentis(L.) Kuntzed的葉片中黃酮類物質(zhì)能抑制白菜種子的萌發(fā)。在醫(yī)學上黃酮類物質(zhì)還具有較好的消炎、免疫、降血糖等功效,因此植物源黃酮的藥用價值與保健功能也備受關(guān)注(閻祥華等，1997；Pérez-Gregorioetal．，2014)。

本研究擬比較互花米草不同器官中黃酮的含量，分析其越冬芽黃酮含量與所在鹽沼中不同地理位置的關(guān)系，以了解黃酮成分是否與該物種在鹽沼灘涂中的擴散有關(guān)。鑒于目前市場上對黃酮物質(zhì)的需求量巨大，試驗還將針對互花米草黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，以期通過互花米草生物質(zhì)的開發(fā)利用為該種群的生態(tài)控制提供思路。

1 試驗方法

1.1 蘆丁標準曲線繪制

以蘆丁(99%，澤朗植提)作為黃酮標準參照物，以95%乙醇配成0.2 mg·mL-1的標準溶液備用。分別將蘆丁標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL移至5 mL塑料離心管中，加入95%乙醇使各管溶液體積至0.5 mL。以NaNO2-Al(NO3)3法反應顯色，加入5% NaNO20.3 mL，搖勻后靜置6 min，再加入10% Al(NO3)30.3 mL，搖勻后靜置6 min，最后加入5% NaOH 1.9 mL，搖勻后靜置15 min。每個濃度重復3次。以不加蘆丁的樣本為空白對照，用紫外分光光度計(U-5100，日本HITACH)于490～510 nm波長范圍內(nèi)掃描蘆丁反應物，測得其最大吸收峰出現(xiàn)于500 nm處，由此測定所有反應物在此處的光密度。以蘆丁濃度為橫坐標，光密度為縱坐標繪制標準曲線。所得標準回歸方程為:y=12.203x-0.0023，R2=0.9977。

1.2 互花米草不同器官黃酮含量分析

于2011年10月采集溫室培養(yǎng)的互花米草植株，分成根、根狀莖、莖、葉鞘、葉、穎稃及種子共7個部分，105 ℃烘1 h后轉(zhuǎn)至65 ℃烘至恒重。稱取0.02 g樣本，用多樣品組織研磨儀(上海凈信科技)以65 Hz的頻率研磨3次，每次45 s。加入70%乙醇1 mL，70 ℃水浴2 h。5000 r·min-1離心10 min后收集上清液，以0.5 mL等濃度的乙醇洗滌殘余物并重復一次，合并上清液。以NaNO2-Al(NO3)3法顯色，測定D500 nm，并對照蘆丁標準曲線計算提取物中的總黃酮含量。

1.3 互花米草越冬芽黃酮含量與所在鹽沼中地理位置的關(guān)系

經(jīng)實測江蘇鹽城丹頂鶴國家級珍禽自然保護區(qū)沿海灘涂互花米草植被總寬為1250 m(垂直于海岸線方向)。于2011年12月選取向陸側(cè)互花米草植被邊緣為零點，每隔250 m向海推進采集越冬芽地上部分。每個位點在平行于海岸線方向上相距100 m設置3個重復。樣本帶回實驗室洗凈，同上述方法烘干，用小型粉碎機粉碎后過60目篩，以同樣方法提取顯色后測定總黃酮含量。

1.4 黃酮提取工藝優(yōu)化設計

為探索互花米草黃酮工業(yè)化提取工藝，以秋季野外采集烘干并儲存半年以上的互花米草葉片為材料，分析提取過程中液料比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間等4個因素對黃酮提取效率的影響。將上述4個因素各取3個水平，采用L9(34)正交表進行正交試驗(表1)。植物材料經(jīng)小型粉碎機粉碎后過60目篩，按預設料液比(重量∶體積，g∶mL)的3/5體積和預設濃度加入乙醇，以預設溫度和時間恒溫水浴。5000 r·min-1離心10 min后收集上清液，以1/5體積的等濃度乙醇洗滌殘余物并重復一次，合并上清液。以上述相同的方法測得提取物中的總黃酮含量。每個處理設5個重復。

表1 互花米草總黃酮提取因素及水平Table 1 Extraction conditions and concentrations to extract flavonoids from S.alterniflora, collected from Yancheng, eastern China

1.5 數(shù)據(jù)分析

文中所列數(shù)據(jù)為平均值±標準誤。以單因素方差分析和Duncan′s檢驗比較互花米草不同器官間以及鹽沼中不同地理位置樣本間黃酮含量的差異，以Pearson相關(guān)性檢驗分析鹽沼中樣本地理位置和黃酮含量的相關(guān)性，以多因素方差分析和Duncan′s檢驗比較正交試驗中不同組合處理間黃酮提取效率的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 互花米草各部位黃酮含量分析

試驗在秋季互花米草樣本的根、根狀莖、莖、葉鞘、葉片、穎稃和種子中均測出了黃酮類物質(zhì)(圖1)?；セ撞萑~片中總黃酮含量遠高于其余各器官，達到了29.128 mg·g-1，為其余各器官的3.6～5.4倍(P<0.05)。其余各器官中，種子的黃酮含量相對偏高，根狀莖的黃酮含量最低，但差異未達到顯著性程度(P>0.05)。

圖1 互花米草各器官黃酮含量Fig.1 Flavonoid contents in different organs of S.alterniflora plants

2.2 互花米草越冬芽黃酮含量與所在鹽沼中不同地理位置的關(guān)系

由圖2可知，不同地理位置的互花米草越冬芽黃酮含量差異很大。該指標隨著植被向海方向的延伸而上升，并與越冬芽所在位置與陸側(cè)植被邊緣的距離呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。除陸側(cè)植被邊緣位點與第2、3位點(250和500 m處)之間差異不顯著以外，第4、5、6位點(750、1000和1250 m處)越冬芽黃酮含量與其余位點都具顯著差異(P<0.05)。在互花米草草灘前緣與潮間帶裸灘相交處，越冬芽黃酮含量最高，達到了17.923 mg·g-1。

2.3 黃酮提取工藝優(yōu)化分析

以提取液中的黃酮含量為指標，互花米草葉片黃酮提取工藝優(yōu)化的正交試驗結(jié)果如表2。由多因素方差分析和極差值可知，影響互花米草黃酮提取效果各因素由強至弱依次為水浴溫度>水浴時間>乙醇濃度>料液比。80 ℃水浴溫度下互花米草黃酮提取效果顯著高于60和70 ℃(P<0.05)，后兩者差異不顯著。水浴2 h后提取物中的黃酮含量高于水浴3 h(P>0.05)和水浴1 h(P<0.05)。70%乙醇黃酮提取效率略高，60%乙醇黃酮提取效率略低，但試驗范圍內(nèi)乙醇濃度差異對互花米草黃酮提取率的影響不顯著(P>0.05)。60和80 ℃水浴溫度下提取效果均有所下降，但差異不顯著。1∶30料液比試驗組黃酮浸出率略高于1∶20和1∶25試驗組，但三者之間差異不具顯著性(P>0.05)。由此初選出適宜互花米草干葉的黃酮提取工藝可能為料液比1∶30，乙醇濃度70%，水浴溫度80 ℃，水浴時間2 h。因該組合不在正交表中，取相同材料進行重復驗證，獲得該工藝條件下互花米草葉片黃酮提取量為18.090 mg·g-1，高于原正交表中所有試驗組的提取結(jié)果。

圖2 互花米草越冬芽黃酮含量隨地理位置的變化情況Fig.2 Flavonoid contents in winter shoots of S.alterniflora in relation to the shoot location, measured as distance from the landside edge of vegetation in the saltmarsh at Yancheng, eastern China

編號Number液料比Ratio of material∶liquid乙醇濃度Alcohol concentration溫度Temperature時間Time結(jié)果 Yield (mg·g-1)S1111110.627±0.331aS2122214.196±0.655bcS3133317.887±0.476dS4212312.092±0.299eS5223116.223±0.361fS6231213.825±0.345bcS7313217.853±0.301dS8321314.808±0.342bS9332113.211±0.296ce均值1 Average 114.237±0.837a13.524±0.850a13.087±0.510a13.354±0.636a均值2 Average 214.047±0.487a15.076±0.340a13.166±0.332a15.291±0.545b均值3 Average 315.291±0.541a14.974±0.591a17.321±0.293b14.929±0.665ab極差 Range 1.2441.5524.2351.937

數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，n=5,同列數(shù)據(jù)后附不同字母者代表在0.05水平上差異顯著。 Numbers represent means±SE,n=5, different letters after the numbers in the "Yield" column indicate significant differences at the level ofP=0.05.

3 討論

互花米草中黃酮含量很高，并主要集中于葉片，這一特征可能與互花米草高光合效率有關(guān)。黃酮是一種高效的抗氧化物質(zhì)，有報道黃酮類化合物在光合作用過程中可很快產(chǎn)生，并在植物光保護過程中具有重要作用(Agatietal．，2013)。研究發(fā)現(xiàn)，互花米草干儲葉片中黃酮含量(18.090 mg·g-1)與目前市場上熱銷的銀杏葉黃酮含量(18.8 mg·g-1)相當(林建原和季麗紅，2013)，并遠高于大豆異黃酮含量(4.784 mg·g-1)(黃蕓等，2007)?；セ撞菘焖俸娓扇~片中黃酮含量更高(29.128 mg·g-1DW)。

鹽沼互花米草植被中越冬芽的黃酮含量沿著向海方向逐漸升高。由于研究地互花米草植被位于潮間帶內(nèi)偏上的位置，離海越近，受海水潮汐的影響越大，生境也越惡劣，因此推測互花米草組織內(nèi)的黃酮含量可能與該植被抵御鹽沼惡劣生境有關(guān)。欽佩等(1991)發(fā)現(xiàn)互花米草在光合過程中能迅速合成黃酮類物質(zhì)。楊曉梅等(1997)進一步研究發(fā)現(xiàn)，一定范圍內(nèi)鹽度越高黃酮含量越高。其他鹽生植物中黃酮含量與環(huán)境鹽度的關(guān)系也有報道(萬洪善和李凡，2012；Buhmann & Papenbrock，2013)。值得關(guān)注的是，其他一些入侵植物中，黃酮含量也相對豐富，如紫莖澤蘭Ageratinaadenophora6.14%(李焱等，2011)、假臭草EupatoriumcatariumVeldkamp 1.36%(湯麗昌等，2011)。較高的黃酮含量可能有助于入侵植物對新環(huán)境尤其是惡劣生境的適應。入侵植物黃酮含量與其入侵性之間的相關(guān)性尚待深入探討。

互花米草黃酮提取工藝優(yōu)化分析過程中，水浴溫度是影響最大的因素，適當?shù)乃〖訜嵊兄诨セ撞蔹S酮的浸出，但過高的水浴溫度和和過長的水浴時間反而對黃酮浸出不利。張彩霞等(2011)推測溫度太高將導致黃酮類化合物的破壞，且乙醇的揮發(fā)也可能使黃酮提取率降低。同樣，如果水浴時間過長，也增加了黃酮在空氣中的氧化時間，降低總黃酮得率(楊紅玲等，2009)。本試驗中70%的乙醇濃度優(yōu)于60%和80%的乙醇,1∶30的料液比也優(yōu)于1∶20和1∶25，但相關(guān)因素導致的差異并無顯著性。唐軍等(2008)曾對米草屬大米草黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，得出最佳提取工藝為料液比1∶10，乙醇濃度70%，溫度80 ℃，提取時間3 h，提取3次。該研究中乙醇濃度和提取溫度與本試驗一致，但提取時間較本試驗長。另外，唐軍等(2008)在正交試驗中沒有分析料液比對提取效率的影響，而是直接采用了1∶10，嘗試了5次提取，發(fā)現(xiàn)前3次提取后，得率已達總提取量的91.2%。本試驗直接借鑒該研究成果，統(tǒng)一提取3次。另外，李盈蕾等(2010)也就大米草黃酮的提取工藝進行了研究，得出優(yōu)化工藝：固液比1∶40，乙醇濃度70%，微波萃取功率400 W，提取6 min。本試驗在早期提取分析過程中也曾嘗試超聲波輔助提取，后因無明顯效果而放棄(數(shù)據(jù)未報道)。

值得注意的是，本試驗初次分析互花米草不同器官中黃酮含量時，所得葉片黃酮含量為后續(xù)提取工藝中最優(yōu)方案所得率的1.6倍。其原因可能為材料差異，前者所用材料為溫室采得的互花米草葉經(jīng)105 ℃快速殺青后烘干至恒重的樣本，由采集至提取未超過7 d。后者為野外采集樣本，由野外至實驗室運輸過程超過2 d，后經(jīng)烘干后又儲存了半年以上才開始分析，其運輸過程中植物細胞中的酶促代謝反應沒有迅速終止，可能會消耗一部分黃酮類次生代謝產(chǎn)物，而后長期的儲存過程也有可能導致部分黃酮物質(zhì)的氧化和降解。因此，互花米草生物質(zhì)的收割和儲存方式在后續(xù)黃酮開發(fā)應用中也應引起注意。另一個原因也可能是在初次分析時，所用料液比達到了1∶100 (0.02 g∶2 mL)，但在以開發(fā)應用為目的的大規(guī)模提取過程中，過高的料液比顯然不合適。

鑒于黃酮類物質(zhì)顯著的保健和藥用功能，其市場開發(fā)潛力巨大?；セ撞萆镔|(zhì)資源豐富，黃酮含量很高，可以成為商品黃酮的一個有效來源。早期有專家曾就米草黃酮的抗炎和免疫活性進行分析，并提出了以生物礦質(zhì)液和總黃酮為核心的米草綠色食物生態(tài)工程理念(張康宣等，1992；Qinetal．，1998)。本研究中互花米草黃酮提取工藝的優(yōu)化為推進相關(guān)產(chǎn)業(yè)化提供了技術(shù)支持。

從另一個角度考慮，互花米草有效成分和生物質(zhì)的輸出，在帶動地方經(jīng)濟的同時，也為該物種的生態(tài)控制創(chuàng)造了機會。Wangetal.(2008)曾就互花米草生態(tài)控制和綜合利用進行過探討，包括直接作為畜禽飼料、其提取物(生物礦質(zhì)液)作為飼料添加劑和動物著色劑、提取后的殘余物作為肥料等。有關(guān)黃酮成分的開發(fā)將大大提高互花米草生物質(zhì)的利用價值。本研究希望以適度的經(jīng)濟利益促使當?shù)匕傩罩鲃訁⑴c生態(tài)控制，并相信該途徑可以成為解決當前我國生物入侵問題的有效策略之一。

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