RP-HPLC法測定酮洛芬凝膠中藥物含量

石 莉，張 晶，李 樂，沙延淳，鄧 波，楊祝仁，楊紅玉

0 引言

疼痛是運動系統(tǒng)常見病，見于組織定性損傷、關(guān)節(jié)退行性病變、肩周炎、腱鞘炎等疾病。酮洛芬(Ketoprofen)又名酮基布洛芬，是一種2-芳基丙酸非甾體抗炎藥，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱作用，對風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊髓炎、痛風(fēng)等具有較好療效[1]，是目前臨床應(yīng)用較多的抗炎鎮(zhèn)痛藥物之一。利用口服藥物控制癥狀往往導(dǎo)致胃腸道及全身性的不良反應(yīng)[2]。凝膠劑直接作用于患處，幾乎不參與全身循環(huán)[3-4]，外用凝膠制劑可以有效避免或緩解口服酮洛芬?guī)淼奈改c道不良反應(yīng)。

酮洛芬凝膠為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的品種[5]，采用內(nèi)標(biāo)法測定酮洛芬凝膠中的藥物含量，存在局限性。為了更好地控制酮洛芬凝膠的質(zhì)量，在廣泛查閱文獻[6-15]與前期試驗的基礎(chǔ)上，筆者建立了RP-HPLC外標(biāo)法測定酮洛芬凝膠中藥物含量，該方法可有效檢出酮洛芬雜質(zhì)。

1 儀器與試藥

L-3000 RIGOL高效液相色譜儀(北京普源精電科技有限公司)，Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm，迪馬公司)。酮洛芬原料藥(湖北迅達藥業(yè)股份有限公司，含量：99.7%，批號：KPO-1102026)，酮洛芬凝膠(自制，批號：110701、110702、110703，規(guī)格：10 g∶0.3 g)，色譜級乙腈(山東禹王實業(yè)有限公司)，磷酸二氫鉀(分析純，天津市博迪化工有限公司)，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)pH值至3.0)-乙腈(50∶50)為流動相，檢測波長為255 nm，流速為1.0 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：10 μL；外標(biāo)法。

2.2 專屬性試驗

2.2.1 樣品制備 空白輔料：精取處方量各空白輔料，制備空白凝膠，精密稱取本品適量置100 mL量瓶中，流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，離心(12 000 r/min) 15 min，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。凝膠樣品溶液：精密稱取凝膠0.33 g(約相當(dāng)于酮洛芬10 mg)，置100 mL量瓶中，流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，離心(12 000 r/min) 15 min，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見圖1。

2.2.2 結(jié)果 空白輔料與空白溶劑基本一致，在酮洛芬主峰處無明顯吸收，不干擾本品的測定。

圖1 酮洛芬色譜圖

2.3 線性關(guān)系與范圍 精密稱取酮洛芬對照品10.50 mg，置10 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含1.05 mg的溶液。分別精密吸取0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度。分別精密吸取10 μL溶液，注入液相色譜儀中，測定色譜峰面積。以進樣量為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程：Y=3 717.5 X-72.678，r=0.999 9。上述試驗結(jié)果表明，酮洛芬在0.525～1.575 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 溶液穩(wěn)定性試驗 按含量測定項下方法，制備供試品溶液，避光放置，分別于配制后0、2、4、6、8 h取樣測定，記錄峰面積，所得酮洛芬峰面積的RSD值為1.42%。實驗結(jié)果表明，該溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 中間精密度試驗 由3名實驗人員，分別在3 d配制供試品溶液1份，每人取樣2次，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算樣品的含量。RSD為1.13%(n=6)，表明本測定方法中間精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 按含量測定項下方法處理樣品(n=6)，配制供試品溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，含量RSD為1.34%，說明本方法重復(fù)性良好。

2.7 準(zhǔn)確度試驗 稱取酮洛芬對照品8、10、12.5 mg，分別置于100 mL量瓶中，再按處方比例加入空白輔料，加流動相適量，超聲溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻，按含量測定項下方法處理樣品，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率，見表1。由表1可見，各濃度下的平均回收率均在96.90%～101.17%之間，平均回收率為98.41%，RSD為1.35%，說明本方法回收率良好。

表1 酮洛芬回收率(n=3)

檢測限和定量限：逐級稀釋含量測定項下的對照品溶液，測定樣品峰的峰高，同時測定相同條件下的色譜基線噪聲，當(dāng)S/N≈3時，檢測限為0.5 ng；當(dāng)S/N≈10時，定量限為5 ng。

2.8 供試品含量的測定 精密稱取本品適量(約相當(dāng)于酮洛芬10 mg)，置100 mL量瓶中，加流動相適量，超聲溶解，放冷至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻；取上述溶液適量，離心(12 000 r/min) 15 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另精密稱取酮洛芬對照品適量，加流動相溶解，制成0.1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液，同法測定，按外標(biāo)法以峰面積計算，即得。按照上述色譜條件和檢測方法，對3批中試樣品及市售藥品進行測定。三批供試品的測定結(jié)果分別為100.20%、100.08%、100.10%。

2.9 光照試驗及光照對含量測定的影響 試驗中發(fā)現(xiàn)，酮洛芬對光敏感。為了進一步了解光照對酮洛芬凝膠的影響，進行了酮洛芬凝膠光照試驗的研究。

取本品適量，置強光照射[(4 500±500) Lx]條件下，分別于5、10 d取樣，按含量測定項下方法處理樣品，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。

圖2 酮洛芬光照試驗色譜圖

由圖2可知，隨著光照時間的增加，2號峰峰面積有顯著增加。通過文獻調(diào)研和前期試驗，推斷2號峰物質(zhì)為1-(3-benzoylphenyl)ethanone，該物質(zhì)為美國藥典酮洛芬項下有關(guān)物質(zhì)D[16]，歐洲藥典酮洛芬項下有關(guān)物質(zhì)A[17]。通過購買1-(3-benzoylphenyl)ethanone雜質(zhì)對照品(EP)，得到圖2中B圖譜，確定2號峰物質(zhì)為1-(3-benzoylphenyl)ethanone，即酮洛芬雜質(zhì)A(EP)。

比較光照0、5、10 d的數(shù)據(jù)，記錄雜質(zhì)A的峰面積百分比，計算雜質(zhì)A與酮洛芬的相對保留時間RRT、酮洛芬的含量百分比，結(jié)果見表2。

表2 光照試驗結(jié)果

結(jié)果表明，經(jīng)光照，酮洛芬含量明顯降低，雜質(zhì)A峰面積百分比明顯增加。而且隨著光照時間的延長，雜質(zhì)A明顯增加，雜質(zhì)A為酮洛芬的光照降解產(chǎn)物。

3 討論

3.1 凝膠樣品處理方法的篩選 因為本品選用卡波姆為凝膠基質(zhì)，該高分子物質(zhì)不適合進入液相色譜系統(tǒng)。如何選擇一種適宜的方法去除卡波姆，成為RP-HPLC法測定本凝膠中酮洛芬含量的關(guān)鍵。筆者嘗試了透析法、離心法、超濾法等一系列方法，最終選擇離心法，用于制備含量測定樣品。該方法簡便、快捷，可靠。

3.2 離心處理條件的篩選 精密稱取酮洛芬凝膠適量(約相當(dāng)于酮洛芬30 mg)，置100 mL量瓶中，加流動相適量，超聲使溶解，放冷至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻；于不同條件下離心處理，取上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，制備供試品溶液。見表3。由表3可知，4 ℃下，本品經(jīng)12 000 r/min離心處理效果較好，離心時間為10～15 min。

3.3 含量測定方法 關(guān)于酮洛芬含量測定方法的文獻較多，包括滴定法、紫外可見分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)等。本文在廣泛查閱文獻的基礎(chǔ)上，建立了RP-HPLC法測定酮洛芬凝膠中藥物含量，該方法能夠有效分離并確認(rèn)了酮洛芬的光降解雜質(zhì)1-(3-benzoylphenyl)ethanone，這一點在其他含量測定方法文獻中未有涉及。

表3 離心條件篩選

3.4 注意事項 本品對光敏感，避光保存，試驗過程中注意避光。

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