化濁通脈散對ASO家兔IL-1表達的影響

程 磊，李慎賢，金鐘太，胡 瑩，吳 迪，張 麗

0 引言

下肢動脈硬化閉塞癥(ASO)是臨床上常見的一種周圍血管疾病，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢，已成為危害中老年人生活及生命的主要疾病之一[1]。目前，研究者提出眾多關于動脈粥樣硬化發(fā)病機制的假說，如脂質(zhì)浸潤學說、單核巨噬細胞作用學說、血栓源性學說、內(nèi)膜損傷反應學說、炎癥學說等，但其確切發(fā)病機制迄今尚未完全闡明。本實驗通過高脂飲食喂養(yǎng)家兔及股動脈血管內(nèi)膜球囊擴張后造成機械性損傷模擬ASO，以化濁通脈散干預檢測實驗前后家兔的血脂變化，實驗結束后應用RT-PCR方法觀察動脈硬化斑塊組織中白介素-1(IL-1)的表達情況，以闡明化濁通脈散治療ASO的作用靶點，進一步從分子生物學角度探討化濁通脈散治療ASO的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康純種的新西蘭雄性白兔50只，10月齡，體重2.8～3.0 kg，由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(遼)2009-0002。

1.2 實驗藥物 化濁通脈散藥物組成：黃芪、金銀花、膽星、半夏、茯苓、白術、澤瀉、焦山楂、川芎、延胡索、水蛭(三九藥業(yè)集團提供，批號：0807021)。通塞脈片由江蘇南星藥業(yè)有限公司提供，批號：120509。西洛他唑片由浙江大冢制藥有限公司提供，批號：120708T。膽固醇：由國藥集團化學試劑沈陽有限公司提供，批號：20120109。牛血清白蛋白：由北京奧博星生物技術有限責任公司生產(chǎn)，批號：20120106。豬油自備。

1.3 實驗試劑 Triozol Reagent：美國Invitrogen Life technologies公司，引物合成：北京華大基因公司，熒光定量PCR試劑盒：大連寶生物。血脂系列試劑由我院生化室提供。

1.4 實驗儀器 德國eppendorf5417R離心機，雅培ARCHITECTci8200全自動生化免疫分析儀，小型臺式離心機(美國SIGMA，1-13)，高速冷凍離心機 sigma 31k5C型，美國PCR擴增儀(德國Biometra)，紫外分光光度計(英國UV-visible Spectrometer，UV300)。

2 方法

2.1 分組及造模 造模前以基礎飼料適應性喂養(yǎng)1周，排除飲食異常者。1周后隨機分為5組，每組10只：即正常組(A)、模型組(B)、化濁通脈散組(C)、西洛他唑組(D)、通塞脈片組(E)，分籠飼養(yǎng)。正常組喂養(yǎng)普通飼料，自由飲水。其余4組自實驗開始喂高脂飲食，每只每日在正常飼料中加膽固醇1 g、豬油5 g。試驗第3天開始，模型組(B)、化濁通脈散組(C)、西洛他唑組(D)、通塞脈片組(E)均在10%烏拉坦麻醉下由左側股動脈插管，4F氣囊導管拖拉左側髂股動脈8次，造成機械性內(nèi)膜損傷[2]。實驗第7天，模型組(B)、化濁通脈散組(C)、西洛他唑組(D)、通塞脈片組(E)按文獻經(jīng)耳緣靜脈一次性注射牛血清白蛋白250 mg/kg，造成免疫性內(nèi)皮損傷[3]，正常組注射等量生理鹽水。

2.2 藥物干預 從21周開始至24周末，各組改為正常飲食。中藥治療組予化濁通脈散，按生藥7.2 g/(kg·d)給藥(藥物均根據(jù)“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表”計算[4])；中藥對照組予通塞脈片0.75片/(kg·d)，按60 kg體重成人每日用量20片計算；西藥對照組予西洛他唑片4.5 mg/(kg·d)，按60 kg體重成人的人兔體表換算公式計算，均混入飼料中喂養(yǎng)。

2.3 血脂測定 各組動物于造模前及治療后分別取外周靜脈血5 mL，均以2 500 r/min離心30 min，取得血清，2 h內(nèi)應用雅培全自動生化免疫分析儀分別檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C，比較造模前及治療后各組指標的變化。

2.4 取材及實時熒光定量PCR檢測IL-1的mRNA含量

2.4.1 取材 實驗結束后用麻醉法處死動物，解剖切取股動脈血管多塊(段)，長約0.2～0.3 cm，放到盛有1 mL Trizol的1.5 mL EP管中保存，制備實驗標本。

2.4.2 液體配制 ①DEPC水：吸出1 mL放在1 000 mL雙蒸水中配成1 ‰DEPC水，放于1 000 mL容量瓶中靜置4 h備用。②75%乙醇：用無水乙醇+DEPC水配，然后放-20 ℃保存(其中DEPC水需先高壓)。

2.4.3 引物設計 目的基因采用RT-PCR方法檢測引物，設計引物如下：

引物名稱引物序列(5′?3′)擴增產(chǎn)物大小(bp)GAPDH rabbit5′ TGCCGCCTGGAGAAAG 3′105 5′ GACCTGGTCCTCGGTGTAG 3′IL-1 rabbit5′ AGACGAGGGCATCCA 3′81 5′ AGAGCCACAACGACTGA 3′

2.4.4 操作步驟 ①Trizol法抽提總RNA：參照Trizol說明書采取一步法提取總RNA。取0.1 g組織置于1.5 mL離心管中加入Trizol 1 mL，在冰浴中迅速勻漿30 s以充分研碎組織，置于室溫中5 min，后加入0.2 mL氯仿?lián)u振15 s，置室溫中3 min，以12 000×g 4 ℃離心15 min，吸取上清液0.5 mL加入0.5 mL異丙醇搖勻，-20 ℃放置2 h，12 000×g 4 ℃離心15 min，棄上清，加75%乙醇1 mL，7 500×g 4 ℃離心15 min，棄上清，加Nuclease free water 15 μL。采用紫外可見分光光度計測定260 nm、280 nm OD值，樣品-80 ℃保存?zhèn)溆谩＂赗NA濃度和純度測定：取1 μL RNA樣本，加79 μL DEPC水，紫外分光光度計測量OD 260與OD 280，二者比值應為1.8～2.0，提示樣本中RNA純度合格。RNA(μg/μL)濃度=OD 260×40×稀釋倍數(shù)(80)/1 000。③逆轉錄合成cDNA：見表1。

表1 逆轉錄合成cDNA

反應條件

37 ℃ 15 min

↓

85 ℃ 5 s

④PCR擴增：見表2。

表2 PCR擴增

⑤PCR擴增：應用ABI 7500 擴增儀。

反應條件 95 ℃ 30 s 1個循環(huán)

↓

95 ℃ 5 s

60 ℃ 34 s 40個循環(huán)

↓

95 ℃ 15 s

60 ℃ 60 s

95 ℃ 15 s 1個循環(huán)

3 結果

3.1 血脂系列檢測結果 見表3。造模前各組血脂指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗結束后，B組、C組、D組、E組與A組比較，TC、TG、LDL-C均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；C組、D組、E組與B組比較，TC、TG、LDL-C均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，HDL-C較B組升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；D組、E組與C組比較，TC、HDL-C差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但TG、LDL-C高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明化濁通脈散對調(diào)控TC、TG、LDL-C有顯著效果。

表3 造模前各組動物血脂指標比較(mmol/L)

3.2 RT-PCR檢測結果 根據(jù)RT-PCR原始檢測結果，儀器可自動按設定的分析方法計算出各樣品的目的基因相對定量結果，即其他各個樣品相對于正常組目的基因mRNA轉錄水平的差異，即2-△△ct值(見表4)，以及各組中IL-1的mRNA相對表達量(見圖1)。

表4 各組對IL-1表達的影響

圖1 Real-time PCR檢測IL-1 mRNA的相對表達量

結果表明，與A組比較，B組、C組、D組、E組的IL-1 mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)，與B組比較，C組、D組、E組的IL-1 mRNA表達水平明顯下降(P<0.01)，與C組比較，D組、E組的IL-1 mRNA表達水平略有升高(P<0.05)。IL-1、GAPDH的擴增曲線和溶解曲線見圖2～圖5。

圖2 IL-1擴增曲線

圖3 IL-1溶解曲線

圖4 GAPDH擴增曲線

圖5 GAPDH溶解曲線

4 討論

下肢動脈硬化閉塞癥是由動脈粥樣硬化引起的一種慢性閉塞性疾病，一般發(fā)生于下肢大中動脈，多見于40歲以上中老年男性[5]，是全身動脈粥樣硬化在患者肢體的局部表現(xiàn)，常伴有腦動脈病變和冠狀動脈硬化性心臟病[6]。本病屬于祖國醫(yī)學中“脫疽”范疇，目前大多數(shù)學者認為該病為本虛標實證，本虛即五臟氣血陰陽的虧虛，標實即瘀、痰、毒、濕熱等證候[7]。本實驗主要認為ASO病機中脾虛為關鍵因素，脾主運化水濕，脾失健運則水濕泛溢成痰濁，痰為濕之變，熱為火之漸，濕熱與痰火異名而同源，痰為陰邪，易阻滯氣機，進而化為瘀?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，痰濁多反映高脂血癥和高凝狀態(tài)[8]，筆者認為，高血脂和高凝狀態(tài)正是動脈粥樣硬化的最主要的危險因素；濕熱內(nèi)蘊是動脈粥樣硬化的重要發(fā)病基礎，是動脈粥樣硬化的主要病理環(huán)節(jié)[9]；血液流變學異常、血小板活化及血管內(nèi)皮損傷是血瘀證候的重要表現(xiàn)。

本實驗遵循中醫(yī)“治病務求其本”的原則，在補陽還五湯的基礎上加減化裁成化濁通脈散。本方重用黃芪，大補元氣，使氣旺則血行，瘀消而不傷正，為君藥。川芎、水蛭：活血祛瘀止痛，為臣藥。茯苓、白術、澤瀉：健脾利水滲濕；半夏、膽南星：祛痰泄?jié)嵬ńj；焦山楂：消痰化瘀；金銀花：清熱解毒消炎；延胡索：行血中之氣，又能行氣中之血，共為佐藥。全方共同組成益氣化瘀通絡、健脾祛痰化濁之功。

現(xiàn)代醫(yī)學認為，動脈粥樣硬化病變是從受累動脈的內(nèi)膜開始，近年來，多數(shù)學者支持內(nèi)膜損傷炎癥反應學說，認為動脈粥樣硬化形成的各種危險因素最終都導致相應動脈內(nèi)膜的損傷和對內(nèi)膜損傷做出的炎癥纖維增生性反應。Ross[10]于1999年指出，動脈粥樣硬化是具有慢性炎癥反應特征的病理過程。IL-1是一種由巨噬細胞分泌的促炎性細胞因子，是體內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥反應的中心介質(zhì)之一[11-12]。IL-1能刺激血管內(nèi)皮細胞活化并自身分泌產(chǎn)生IL-1β，IL-1β是重要的前炎癥細胞因子，在動脈粥樣硬化形成過程中起一定促進作用[13-14]。IL-1β能引起單核細胞聚集和浸潤，又能移入內(nèi)膜形成巨噬細胞。動脈粥樣硬化形成過程中始終都有各種促炎癥細胞因子的參與，進一步研究證實促炎性細胞因子IL-1在病灶發(fā)展的調(diào)節(jié)中起關鍵作用[15]。

本實驗用實時熒光定量PCR檢測結果顯示，化濁通脈散對實驗家兔的動脈硬化斑塊組織中IL-1的表達有明顯的降低作用，證明此方通過降低促炎性細胞因子IL-1，可有效抑制其刺激血管內(nèi)皮細胞活化，并使其減少分泌前炎癥細胞因子IL-1β，阻止單核細胞及淋巴細胞浸潤到動脈內(nèi)膜形成巨噬細胞，從而有效延緩和防止動脈粥樣硬化形成的病變進展。

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