蛋白激酶B結(jié)構(gòu)與功能研究進展

李 欣

(成都大學 體育學院，四川 成都 610600)

0 引 言

蛋白激酶B 又名Akt，分子量為56 道爾頓，因其具有與蛋白激酶A 與C 的高度同源性而被命名為蛋白激酶B.隨著小鼠胸腺瘤中的反轉(zhuǎn)錄病毒v-Akt 的提純，同源基因c-Akt 也被發(fā)現(xiàn)，其編碼的蛋白產(chǎn)物能使絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，稱之為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt.研究發(fā)現(xiàn)，人類至少存在3 種Akt 家族成員:Aktl/PKBα、Akt2/PKBβ 和Akt3/PKBγ.Akt1/2/3 分別位于14 號染色體短臂3 區(qū)2 帶，19 號染色體短臂1 區(qū)3 帶和1 號染色體短臂4 區(qū)4 帶［1］.Aktl 和Akt2 在人體的大腦、胸腺與心肺中廣泛分布，水平較高，而Akt3 則主要在人體的大腦和睪丸中表達，在心肺、脾和骨骼肌中水平較低.該3 種異構(gòu)體均有相似的催化功能域，可被第二信使調(diào)節(jié)，是細胞生長信號通路中的傳感器，在生長因子或胰島素介導的信號轉(zhuǎn)導中扮演重要角色，在營養(yǎng)代謝、細胞生長、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞存活中也具有重要作用.

1 PKB 結(jié)構(gòu)

3 種Akt 的異構(gòu)體都包含相同的保守功能域結(jié)構(gòu):N 端的PH 功能域，中間的激酶催化功能域和C端含疏水基序的調(diào)節(jié)功能域.PH 功能域包括大約100 個氨基酸，可與細胞膜上由PI3K 產(chǎn)生的PIP3的頭基結(jié)合，并存在PDK1 的結(jié)合位點，阻斷這種結(jié)合會加重AGC 激酶活化環(huán)的磷酸化［2］.PKB 的催化功能域在分子的中間區(qū)域，與PKC、P70S6K 等AGC 激酶高度相似，該功能域的氨基小葉中存在一個活化環(huán)，在活化環(huán)中的DFG 和APE 基序間有一個保守的蘇氨酸殘基308，該殘基的磷酸化可部分激活PKB［3］.所有PKB 異構(gòu)體C 端均有一個約40 個氨基酸的延伸片段，該區(qū)域含有疏水基序(hydrophobic motif，HM).人體PKB 的HM 序列為:苯丙氨酸/脯氨酸/谷氨酰胺/苯丙氨酸/絲氨酸/酪氨酸.當PKB 的HM發(fā)生缺失突變時，Akt 的酶活性會完全喪失.最新的研究表明，HM 對于PKB 的激酶催化活性具有變構(gòu)調(diào)節(jié)作用，催化功能域的氨基小葉和αB 螺旋、αC螺旋以及β－5 片狀結(jié)構(gòu)形成一個疏水性的磷酸化袋狀結(jié)構(gòu)，HM 通過與該結(jié)構(gòu)的結(jié)合，增強催化功能域的穩(wěn)定性，提高磷酸基團的轉(zhuǎn)移率［4］.

2 PKB 的磷酸化調(diào)節(jié)

PKB 含有2 個特殊的磷酸化位點，Akt1 的蘇氨酸殘基308 位于激酶催化功能域的活化環(huán)上，而絲氨酸殘基473 則位于C 端調(diào)節(jié)域中.Akt2 的相應殘基為蘇氨酸309 和絲氨酸474，而Akt3 由于只有454 個殘基，其相應的殘基位為蘇氨酸305.PKB 被IGF－1 信號通路激活時，伴隨著蘇氨酸殘基308 和絲氨酸殘基473 的磷酸化，當使用PI3K 抑制劑時，殘基的磷酸化和PKB的激活同時消失.當蘇氨酸殘基308 和絲氨酸殘基473 發(fā)生丙氨酸突變時，PKB 的活性下降85% ～95%.而當蘇氨酸殘基308 或絲氨酸殘基473 發(fā)生天冬氨酸突變時，PKB 的活性可增大5 倍.兩者同時發(fā)生天冬氨酸突變時，PKB 的活性可增大20 倍.蘇氨酸殘基308 發(fā)生單磷酸化時，若絲氨酸殘基473 未被磷酸化，C 端小葉上的αB 和C螺旋以及活化環(huán)會發(fā)生紊亂;若絲氨酸殘基473 發(fā)生天冬氨酸突變時，激酶催化功能域會從無序轉(zhuǎn)化為有序，導致激酶催化功能域穩(wěn)定在激活狀態(tài).蘇氨酸殘基308 的磷酸化可部分活化PKB，絲氨酸殘基473的單獨磷酸化則對PKB 的活性基本無效，但PKB的完全激活則需要絲氨酸殘基473 的磷酸化.蘇氨酸殘基308 是被PDK1 磷酸化的，但絲氨酸殘基473的磷酸化則充滿爭議.理論上，絲氨酸殘基473 的磷酸化和蘇氨酸殘基308 一樣依賴于PI3K，PDK1 應成為絲氨酸殘基473 的磷酸化激酶，但敲除PDK1的ES 細胞中絲氨酸殘基473 呈現(xiàn)出與野生型細胞相似的磷酸化，而蘇氨酸殘基308 的磷酸化則完全消除.但過表達的PDK1 可以增加絲氨酸殘基473的磷酸化，表明PDK1 可以間接增加絲氨酸殘基473的磷酸化.有報道認為，在某種情況下PKB 可以發(fā)生自磷酸化以及絲氨酸殘基473 被PDK2 磷酸化［5］.此外，ILK 也與絲氨酸殘基473 的磷酸化相關(guān)，它可以磷酸化絲氨酸殘基473，其抑制劑可以阻斷PKB 絲氨酸殘基473 的磷酸化，這些研究表明，ILK 在絲氨酸殘基473 的激活過程中發(fā)揮作用，但能否直接磷酸化PKB 則還充滿爭議.研究表明，酪氨酸磷酸化在PKB 調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用［6］.PKB 催化區(qū)域中的酪氨酸殘基315 和326 可通過PKB C 端的脯氨酸/X/X/脯氨酸模序(X 為任意氨基酸)與Src分子C 端的SH3 功能域結(jié)合，導致磷酸化，在胰島素和過釩酸鈉作用下，酪氨酸殘基474 會被磷酸化，該殘基突變?yōu)楸奖彼釙r，會減少蘇氨酸殘基308的磷酸化程度，使PKB 活性下降55%.PKB 的晶體結(jié)構(gòu)顯示，酪氨酸殘基474 參與HM 與疏水袋結(jié)合的過程，酪氨酸殘基474 的芳香環(huán)與亮氨酸殘基214 相互作用，羥基與精氨酸殘基207 形成氫鍵結(jié)合.因此，當474 突變后，HM 與疏水袋親和力下降，造成PKB 的活性降低.而這也會降低PKD1 與PKB的作用能力.絲氨酸殘基473 與酪氨酸殘基474 的磷酸化是互斥的，對磷酰氨基酸和胰蛋白多肽的分析顯示，兩者從不同時磷酸化，這提示磷酸化的絲氨酸殘基474 具有阻斷殘基473 的作用，表明474 殘基的磷酸化可以抑制PKB 的活性.由于這些酪氨酸在AGC 激酶中普遍存在，這也可能是AGC 蛋白家族的普遍調(diào)節(jié)機制.

3 PKB 的上游物質(zhì)

通常，PKB 在沒有受到外界刺激時一般以非活化形式在細胞質(zhì)中表達，當存在IGF-1 等刺激時，細胞膜上的受體酪氨酸激酶磷酸化，PI3K 信號通路激活，PI3K 是產(chǎn)生第二信使3、4、5 三磷酸磷脂酰肌醇的關(guān)鍵酶，3、4、5 三磷酸磷脂酰肌醇可與PKB 的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使PKB 從細胞質(zhì)異位至細胞膜，并發(fā)生構(gòu)象改變.當存在PI3K 抑制劑或PH 功能域缺失時，該異位被阻斷.當PKB 異位至細胞膜并發(fā)生構(gòu)象改變后，PIP3 可激活PDK1 的活性，導致PDK1 和PDK2 磷酸化激酶催化功能域活化環(huán)上蘇氨酸殘基308 和調(diào)節(jié)功能域絲氨酸殘基473.磷酸化以及余下的激活過程可被PI3K 的抑制劑渥曼青霉素和LY294002 阻斷.絲氨酸殘基473 的磷酸化是PKB激活的關(guān)鍵步驟，可穩(wěn)定其活化狀態(tài).當絲氨酸殘基473 被磷酸化后，PKB 從細胞膜進入細胞質(zhì)或細胞核［7］.此外，cAMP-PKA 途徑、鈣調(diào)蛋白激酶和熱休克蛋白27 等可以獨立激活PKB.

4 PKB 的生理作用

4.1 PKB 可以促進細胞增殖

p21 及其相關(guān)家族成員p27 可以通過可逆抑制一些周期素依賴激酶來阻斷細胞周期.而PKB 通過磷酸化p21 可以抑制細胞周期阻滯［8］.表皮生長因子受體-2 在乳腺癌和卵巢癌中過表達能激活PKB，PKB 磷酸化p21 的蘇氨酸145 殘基.該過程本身不影響p21 的抑制作用，但可以阻止p21 進入細胞核，而p21 必須在細胞核中才能發(fā)揮其抑制細胞增殖的作用.PKB 還可以調(diào)節(jié)周期素依賴激酶抑制子p27的轉(zhuǎn)錄，激活的PKB 或過表達的PKB 可以降低p27在細胞中的水平，促進細胞增殖［9］.此外，細胞周期進程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者還包括細胞周期蛋白(D1/D2/D3)，它可以刺激G1 期，其需要細胞周期蛋白激酶4 和細胞周期蛋白激酶6 的活性.細胞周期蛋白受轉(zhuǎn)錄水平、翻譯和蛋白穩(wěn)定性控制，許多生長因子促進細胞周期蛋白的轉(zhuǎn)錄，PI3K 信號通路在此過程中扮演重要角色.過表達的PI3K 和PKB 可以刺激細胞周期蛋白的翻譯率.細胞周期蛋白水平受其從細胞核異位至細胞膜的影響，在細胞膜細胞周期蛋白1 可被蛋白體的泛素化降解，其關(guān)鍵的步驟是由GSK3 磷酸化細胞周期蛋白1 的蘇氨酸殘基286，這可以促進細胞周期蛋白1 與核輸出蛋白染色體區(qū)域維持蛋白1 的結(jié)合.激活的PKB 可以導致GSK3 的失活，降低GSK3 對細胞周期蛋白1 的磷酸化，保持細胞核中細胞周期蛋白1 的較高水平.E2F 是一種通用轉(zhuǎn)錄因子，控制多種DNA 合成及細胞周期調(diào)節(jié)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄.在細胞進入細胞周期前，E2F 與袋狀分子結(jié)合而處于無活性狀態(tài).當這些袋狀蛋白在細胞周期蛋白和(或)細胞周期依賴性蛋白激酶磷酸化時，E2F 被釋放而得以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性.PKB通過降低p27 的表達，使袋狀分子高度磷酸化，促進E2F 的轉(zhuǎn)錄活性，使細胞從G1 期進入S 期［10］.

4.2 PKB 可以抑制細胞凋亡

血清和某些生長因子能抑制細胞的凋亡，但它們傳遞抗凋亡信號的機制尚不清楚.Kennedy 等［10］研究了5 種生長因子的下游底物，Ras、Raf、Src、PI3K 和PKB 的抑制凋亡能力發(fā)現(xiàn)，Ras、Raf 和Src都不能傳遞存活信號，而PI3K 的抑制能促進凋亡，PKB 的活化則能抑制凋亡［11］.PKB 可以通過抑制調(diào)節(jié)凋亡的蛋白來促進細胞生存，PKB 的底物BAD 可以通過與Bcl-XL的結(jié)合來促進凋亡，PKB 磷酸化BAD 可以使BAD 與14-3-3 蛋白結(jié)合，阻止其與Bcl-XL結(jié)合來抑制凋亡.叉頭蛋白家族成員都含有Akt磷酸化的序列，可被Akt 磷酸化.而磷酸化修飾可使叉頭蛋白改變其細胞定位，在未被Akt 磷酸化修飾時它們大部分定位于細胞核，促進凋亡相關(guān)基因Fas-L 和Bim 的轉(zhuǎn)錄，促進細胞凋亡.被Akt 磷酸化活化后，它們從細胞核異位至細胞質(zhì)與14-3-3 蛋白結(jié)合，抑制細胞凋亡［12］.此外，PKB 還可以直接磷酸化并抑制caspase 蛋白酶.大多數(shù)caspase 具有PKB磷酸化位點，調(diào)節(jié)凋亡的關(guān)鍵酶caspase-9 的磷酸化位點為絲氨酸196.PKB 可以磷酸化caspase-9 從而阻斷內(nèi)源性蛋白酶活性，在凋亡控制過程中發(fā)揮重要功能.過表達的活性PKB 還可磷酸化凋亡信號調(diào)節(jié)激酶I 的絲氨酸殘基83，抑制其活性，并降低具有促凋亡作用的JNK 的活性.

4.3 PKB 促進胰島素信號應答

PKB 是PI3K 的關(guān)鍵下游效應子，PKBβ 在脂肪組織等胰島素應答組織中高表達，是保證糖原正常合成的關(guān)鍵基因［13］.PKBβ 缺乏的小鼠表現(xiàn)出典型的II 型糖尿病特征，以及肝臟和肌肉出現(xiàn)胰島素抵抗.隨著胰島素水平增高，胰島的體積和數(shù)量發(fā)生顯著增加.糖原合成酶激酶3 在胰島素刺激時可以磷酸化滅活糖原合成酶，該激酶是PKB 的底物，GSK3α 和β 的磷酸化位點絲氨酸21 和絲氨酸9 均可被PKB 磷酸化而失活.PKB 的PI3K 依賴形式介導該過程，構(gòu)成了胰島素調(diào)節(jié)糖原合成信號通路中的重要旁路［14］.研究表明，PKB 磷酸化滅活GSK3后，可以導致肝臟和脂肪組織葡萄糖和氨基酸轉(zhuǎn)化為糖原和蛋白質(zhì).PKB 可以磷酸化激活脂肪組織中的cAMP-磷酸二酯酶3B 絲氨酸殘基273，導致磷酸二酯酶3B 的激活，降低cAMP 的活性以及PKA 的活性，并調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)核苷酸的水平.心臟6-磷酸果糖激酶-2 可被PKB 磷酸化絲氨酸殘基466，導致酶活性增高，促進糖酵解.葡萄糖運輸?shù)鞍? 是胰島素敏感的葡萄糖轉(zhuǎn)運分子之一.在胰島素的作用下，GluT4 從胞漿向質(zhì)膜移位.Akt 可以促進葡萄搪的轉(zhuǎn)運和葡萄糖運輸?shù)鞍? 向質(zhì)膜的移位，增加葡萄糖的運輸，并可促進脂肪細胞的分化.其可能機制為當存在胰島素等刺激因子時，PKB 在細胞膜上被PDK1 和PDK2 完全活化，進入特定的葡萄糖運輸?shù)鞍? 小泡中，促使其異位至細胞膜上.其他PKB 的底物包括胰島素受體底物1，它的磷酸化可以抑制PI3K 募集到細胞膜上.在胰島素長期刺激時，在切斷PI3K 活性的負反饋通路中具有重要作用.PKB的過表達在幾個胰島素反應細胞株中可以刺激營養(yǎng)的攝取如葡萄糖和氨基酸，并誘導其基因表達通常介導的胰島素.

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