利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究益生菌酸耐受應(yīng)答過程中相關(guān)蛋白的變化

楊 靜 王進(jìn)波 齊莉莉 姜淑貞

(1.浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，寧波 315100;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018)

將菌體預(yù)先暴露在較溫和的酸脅迫環(huán)境中進(jìn)行酸適應(yīng)，可提高菌體在致死性酸脅迫環(huán)境中的耐受能力，這種能力被稱為細(xì)菌的酸耐受應(yīng)答(ATR)。酸耐受應(yīng)答能夠提高益生菌對(duì)胃酸的耐受力，有助于其順利抵達(dá)腸道后段，并在其中黏附、定植，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能［1］。

Goodson等［2］在1989年首先發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的酸耐受應(yīng)答現(xiàn)象，他將埃希氏大腸桿菌放入非致死酸環(huán)境中適應(yīng)一段時(shí)間后，該菌可以在致死酸度下正常存活。Jan等［3］將對(duì)數(shù)生長期的費(fèi)氏丙酸球菌SI41直接置于pH 2.0環(huán)境中，30 min后該菌存活率僅為4.3%;若將此菌在pH 5.0的環(huán)境中培養(yǎng)適應(yīng)1 h后，再轉(zhuǎn)移至pH 2.0環(huán)境中，活菌數(shù)則沒有顯著降低，說明在此過程該菌產(chǎn)生了酸耐受應(yīng)答反應(yīng)。之后，研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些有益菌，如乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌等也存在酸耐受應(yīng)答現(xiàn)象［4］。在酸耐受應(yīng)答過程中，細(xì)菌的能量及代謝狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，而這些改變的直接執(zhí)行者即為蛋白質(zhì)。借助蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定分析細(xì)菌在酸耐受應(yīng)答過程中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，可以讓人們更直接地了解細(xì)菌代謝狀態(tài)的改變。

1 碳水化合物代謝相關(guān)蛋白在酸耐受應(yīng)答過程中的變化

Zhai等［5］發(fā)現(xiàn)，德氏乳桿菌在酸適應(yīng)后主要碳水化合物代謝酶發(fā)生差異性表達(dá)。利用液-質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行的分析表明，該菌中多種與碳水化合物代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)水平發(fā)生改變，包括糖酵解途徑相關(guān)蛋白，如葡萄糖激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和丙酮酸激酶等;丙酮酸代謝相關(guān)蛋白，如乙酸激酶;磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白，如6-磷酸葡糖脫氫酶等。丙酮酸對(duì)細(xì)胞代謝至關(guān)重要，在細(xì)胞內(nèi)可被乳酸脫氫酶還原成乳酸供能或被氧化脫羧生成乙酰輔酶A，進(jìn)而合成脂肪酸［6］。在酸適應(yīng)階段，保加利亞乳桿菌丙酮酸氧化酶和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平升高，而乳酸脫氫酶的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。這意味著乳酸合成減少，乙酰輔酶A產(chǎn)量增加，使得細(xì)胞膜脂肪酸的合成增多。這種改變增加了細(xì)胞膜的剛性和抗?jié)B性，使得細(xì)胞膜對(duì)質(zhì)子的滲透性降低，以對(duì)抗酸性條件下的質(zhì)子涌入［7-8］。在酸適應(yīng)階段，其他乳酸桿菌中也存在類似的丙酮酸代謝改變的情況［9-10］。

Wu等［11］報(bào)道，在酸脅迫過程中，干酪乳桿菌體內(nèi)8種參與碳水化合物代謝的蛋白表達(dá)上調(diào)，包括N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶(N-acetyl-glucosamine deacetylase，NagA)、氨基葡萄糖脫氨酶(glucosamine deaminase，NagB)、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡糖胺變位酶、乳酸脫氫酶、二磷酸硫胺素輔羧酶、半乳糖變旋酶和磷酸烯醇丙酮酸蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶。其中，NagA催化6-磷酸-N-乙酰-D-葡糖胺和6-磷酸-D-果糖的代謝，而6-磷酸-N-乙酰-D-葡糖胺是N-乙酰-D-葡糖胺和二磷酸尿苷(uridine diphosphate，UDP)-N-乙酰胞壁酸的前體，這2種物質(zhì)是細(xì)胞壁肽聚糖生物合成所必需的，這表明這些酶的表達(dá)水平升高可能與膜受損后的修復(fù)有關(guān)。有研究推測，干酪乳桿菌中NagB的表達(dá)上調(diào)或許與細(xì)胞質(zhì)pH的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)。其他6種蛋白與糖酵解相關(guān)，這些蛋白的表達(dá)上調(diào)說明酸脅迫后的干酪乳桿菌糖酵解加強(qiáng)。Chen等［12］發(fā)現(xiàn)，酸脅迫后的干酪乳桿菌，其H+-ATP酶的表達(dá)升高，可以推測在酸脅迫過程中，干酪乳桿菌糖酵解加強(qiáng)，ATP合成增多;同時(shí)，H+-ATP酶利用ATP水解釋放的能量將胞內(nèi)質(zhì)子運(yùn)送出細(xì)胞，從而維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)外pH的動(dòng)態(tài)平衡。對(duì)乳酸乳球菌的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象［13］，NagB濃度的迅速升高使得乳酸乳球菌可以利用牛奶中的N-乙酰葡糖胺作為替代碳源誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氨的產(chǎn)生，氨可以用于菌體內(nèi)含氮分子的生物合成或者維持細(xì)胞質(zhì)pH的動(dòng)態(tài)平衡。

2 分子伴侶、氨基酸代謝及核糖體蛋白在酸耐受應(yīng)答過程中的變化

Wu等［11］指出，干酪乳桿菌中熱休克蛋白DnaK為酸誘導(dǎo)蛋白，在蛋白質(zhì)的成熟、降解及修復(fù)中扮演重要角色。保加利亞乳桿菌的2種翻譯延伸因子熱不穩(wěn)定延伸因子(elongation factor thermo unstable，EF-Tu)、延伸因子 G(elongation factor G，EF-G)在酸脅迫時(shí)表達(dá)上調(diào)，干酪乳桿菌中也存在類似的情況。除在蛋白質(zhì)翻譯中的作用外，EF-Tu、EF-G在蛋白質(zhì)的折疊中具有類似于分子伴侶的功能，而且核糖體和氨酰tRNA-EF-Tu之間的相互作用對(duì)控制翻譯的準(zhǔn)確性具有重要作用［5］。EF-Tu、EF-G 在酸脅迫時(shí)的表達(dá)上調(diào)有利于保證酸脅迫環(huán)境下菌體內(nèi)蛋白質(zhì)合成過程中的準(zhǔn)確翻譯及正確折疊。

當(dāng)細(xì)胞克服酸性環(huán)境時(shí)，細(xì)胞內(nèi)氨基酸合成會(huì)受到限制，可能是由于這一過程中的ATP結(jié)合效率降低［14-15］。細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度的降低可能會(huì)引起細(xì)胞通過其他途徑來獲取氨基酸，如通過肽酶(Pep)或者肽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的過量表達(dá)途徑。保加利亞乳桿菌的2種肽酶(PepN和PepO1)在酸脅迫時(shí)表達(dá)上調(diào)［5］，鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌等也存在同樣的情況［10-11］。Sánchez 等［16］發(fā)現(xiàn)，長雙歧桿菌在pH 4.8環(huán)境下，其PepP的表達(dá)水平高于pH 7.0環(huán)境下。在酸脅迫環(huán)境下，干酪乳桿菌中PepT、PepF、PepD3和PepN等幾個(gè)肽酶的表達(dá)也被誘導(dǎo)［11］。Zhai等［5］推測這些肽酶可能會(huì)與Clp蛋白酶合作，降解酸脅迫導(dǎo)致的錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，釋放出氨基酸，然后循環(huán)利用生成新的蛋白質(zhì)。

酸脅迫環(huán)境中，保加利亞乳桿菌的2種核糖體蛋白R(shí)piM、RpsS表達(dá)水平升高，穩(wěn)定生長期的干酪乳桿菌核糖體大亞基蛋白中L10的表達(dá)水平下調(diào)，小亞基蛋白中S2的表達(dá)水平上調(diào)［17］。核糖體蛋白被認(rèn)為是熱休克和冷休克的傳感器［18］，可能也與酸耐受應(yīng)答有關(guān)。

3 p H傳感及自適應(yīng)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白在酸耐受應(yīng)答過程中的變化

一般而言，細(xì)菌相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)感知環(huán)境的變化，這些信號(hào)刺激細(xì)胞內(nèi)的各種反應(yīng)機(jī)制，從而引發(fā)細(xì)菌代謝上的適應(yīng)性變化。其中，由膜結(jié)合型傳感器和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的調(diào)控效應(yīng)子組成的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signal transduction system，TCSTS)對(duì)于細(xì)菌的適應(yīng)和存活是必不可少的。保加利亞乳桿菌體內(nèi)存在5個(gè)完整的TCSTS。在這些系統(tǒng)中，一種類似于VicK/VicR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可以感知酸脅迫并作出反應(yīng)。酸性環(huán)境觸發(fā)了VicK樣受體及同源調(diào)控子VicR樣蛋白的磷酸化，磷酸化的VicR樣蛋白進(jìn)而活化或阻遏pH應(yīng)答基因的表達(dá)，進(jìn)行自適應(yīng)調(diào)節(jié)［5］。

此外，在乳酸菌對(duì)酸耐受應(yīng)答的反應(yīng)中，幾種轉(zhuǎn)錄調(diào)控子在協(xié)調(diào)基因表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，如參與碳水化合物代謝的CggR阻遏蛋白。另外，在保加利亞乳桿菌中，還發(fā)現(xiàn)一種潛在的未知功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子Ldb0677參與酸耐受應(yīng)答，該因子在酸適應(yīng)階段表達(dá)水平上調(diào)，Ldb0677的過度表達(dá)提高了細(xì)菌的酸耐受性。關(guān)于Ldb0677的具體調(diào)控過程及功能，還需要進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

目前為止，益生菌的酸耐受應(yīng)答可能的機(jī)制有質(zhì)子泵、產(chǎn)生堿性物質(zhì)、受損蛋白質(zhì)的修復(fù)、受損DNA的修復(fù)、細(xì)胞膜成分的改變等［19］。而蛋白質(zhì)組學(xué)分析是進(jìn)一步了解這些機(jī)制的重要工具，對(duì)于提高益生菌的耐酸力，解決益生菌在胃腸道存活率偏低的現(xiàn)象具有十分重要的意義。

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