甲醇芽孢桿菌蛋白酶的水解特性及酪蛋白水解產(chǎn)物活性分析

楊智杰,鄭 喆,蔡 淼,趙 笑,羅天淇,黎潤坤,陳 超,曹永強,楊貞耐,,*

(1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京工商大學(xué),北京 100048;2.東君乳業(yè)(禹城)有限公司,山東 禹城 251200)

蛋白酶是一種具有復(fù)雜功能結(jié)構(gòu)并能夠催化蛋白質(zhì)水解生成多肽以及小分子氨基酸的酶,主要來源于動物、植物和微生物,其中微生物是蛋白酶的良好來源[1]。微生物蛋白酶是細菌、酵母或者霉菌等一些微生物生長過程中產(chǎn)生的酶;由于微生物繁殖速率快、生長條件易于控制、具有良好的穩(wěn)定性和特異性等優(yōu)點,該類蛋白酶己經(jīng)成為工業(yè)應(yīng)用中的主要酶制劑來源。芽孢桿菌是生成蛋白酶最重要的微生物菌屬之一[2-3];地衣芽孢桿菌作為生產(chǎn)中性和堿性蛋白酶的主要菌種己被報道多次[2,4]。

許多微生物蛋白酶在具有對酪蛋白高效的水解活力的同時,還可以切割牛乳中κ-酪蛋白的特定肽鍵,造成酪蛋白膠束被破壞,使牛乳由液態(tài)凝結(jié)為半固態(tài),從而具有一定的凝乳活性。本實驗所用的甲醇芽孢桿菌LB-1蛋白酶是一種從黃酒麥曲中分離出的具有較高凝乳活力的蛋白酶[5],含有759 個氨基酸,分子質(zhì)量為80.37 kDa,pI值為9.23,最適凝乳溫度和pH值分別為50 ℃和6.5。該酶應(yīng)用于馬蘇里拉干酪加工中具備部分代替商業(yè)凝乳酶的潛力[6]。但是該酶的蛋白水解活力包括引起凝乳的關(guān)鍵水解位點、水解產(chǎn)物活性等仍鮮有深入研究。

本研究旨在了解蛋白酶LB-1的蛋白水解特性,特別是其蛋白水解的最適條件及穩(wěn)定性、引起凝乳的關(guān)鍵水解位點,并對其酪蛋白水解產(chǎn)物的生物活性進行評價。以期為具有凝乳作用的甲醇芽孢桿菌蛋白酶在乳制品加工中的應(yīng)用,以及該酶酪蛋白水解產(chǎn)物在功能性食品領(lǐng)域的研究開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇芽孢桿菌LB-1蛋白酶由本實驗室提取分離純化[5],并于-80 ℃冷凍保藏。

酪蛋白酸鈉、乳清蛋白(均為食品級) 新西蘭恒天然公司;2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽離子自由基測定試劑盒 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS12恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)實驗設(shè)備有限公司;CR21G III高速離心機 日本日立公司;Mini-Protein蛋白電泳設(shè)備、全自動凝膠成像設(shè)備 美國Bio-Rad公司;Infinite M200 PRO NanoQuant酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;PHTX-21電極放大器 美國Omega公司。

1.3 方法

1.3.1 不同條件對蛋白水解活力的影響測定

取1 g/100 mL酪蛋白酸鈉溶液0.2 mL,加入0.001 g/mL酶液混勻,水浴恒溫40 ℃,反應(yīng)10 min后取出,加入0.4 mol/L三氯乙酸溶液0.4 mL終止反應(yīng),10 000 r/min離心5 min;取0.5 mL上清液,加入2 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和0.5 mL福林-酚試劑;40 ℃反應(yīng)20 min,測定在680 nm波長處吸光度A680nm?？瞻讓φ?取0.2 mL酶液與0.4 mol/L三氯乙酸0.4 mL混合,使其滅活,加入0.2 mL酪蛋白酸鈉溶液,重復(fù)上述步驟,上清液作為空白對照,測吸光度A’680nm。本實驗條件下,60 min引起A680nm增加0.001單位所需的酶量為1 個酶活力單位,1 mL酶液的蛋白水解活力計算公式如下:

蛋白水解活力/(U/mL)=2×(A680nm-A’680nm)

1.3.1.1 溫度的影響

取1 g/100 mL的酪蛋白酸鈉溶液0.2 mL,加入0.001 g/mL蛋白酶LB-1酶液0.2 mL;分別在22、27、32、37、42、47、52、57、62 ℃反應(yīng)10 min;重復(fù)3 次測定蛋白水解活力。

1.3.1.2 pH值的影響

取pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的1 g/100 mL酪蛋白酸鈉溶液0.2 mL,加入0.001 g/mL蛋白酶LB-1酶液0.2 mL,重復(fù)3 次測定蛋白水解活力。

1.3.1.3 添加物的影響

酶在金屬鹽(氯化鉀、氯化鈉、氯化鋰、氯化鋅、氯化鎂、氯化鈣、氯化銅、氯化鎘、氯化鉛)、有機溶劑(甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈和二甲基亞砜)、變性劑(尿素)、洗滌劑(曲拉通-100、SDS)的溶液中孵育2 h,測定其蛋白水解活力,計算剩余酶活力占未處理酶活力的百分比。

1.3.2 蛋白酶對乳清蛋白、酪蛋白水解作用分析

1.3.2.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)分析

SDS-PAGE按照Laemmli[7]的方法進行。分離膠12.5%,濃縮膠4.5%;電泳開始時電壓為45 V,當(dāng)樣品從濃縮膠進入分離膠后把電壓調(diào)至65 V,直到樣品離末端1.5 cm停止。使用考馬斯亮藍R250染色,脫色過夜。

1.3.2.2 水解過程中pH值和氧化還原電位(oxidationreduction potential,ORP)分析

采用Topcu等[8]的方法,用iCinac(12 VDC,96 W)測量pH值和ORP。在校準(zhǔn)之后將Pt電極直接插入接種蛋白酶LB-1的10 g/100 mL乳清蛋白、酪蛋白溶液中,深度為5 cm。電極通過放大器連接到數(shù)據(jù)記錄儀進行數(shù)據(jù)采集。每5 min記錄一次數(shù)據(jù),持續(xù)360 min。

1.3.2.3 水解時間和酶質(zhì)量濃度對酪蛋白和乳清蛋白水解的影響

分別在1 mL 1 mg/mL酪蛋白和乳清蛋白溶液中加入100 μL 0.625 mg/mL的蛋白酶LB-1,在40 ℃分別反應(yīng)0、5、15、30、60、120、180、360 min后沸水浴5 min滅酶,用SDS-PAGE分析測定蛋白水解程度。

將不同質(zhì)量濃度(0、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/mL)的酶液加入1 mL 1 mg/mL的酪蛋白和乳清蛋白中,水解30 min后沸水浴5 min滅酶,用SDS-PAGE分析測定蛋白水解程度。

1.3.3 酶質(zhì)量濃度對酪蛋白不同組分標(biāo)準(zhǔn)品水解的影響

分別配制質(zhì)量濃度為0、0.015 625、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL蛋白酶LB-1溶液,取10 μL分別加入100 μL 10 mg/mL α-、β-、κ-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中,50 ℃反應(yīng)30 min,沸水浴5 min滅酶,使用1.3.2.1節(jié)方法測定蛋白水解程度。

1.3.4 蛋白酶對κ-酪蛋白水解位點分析

參照王顏顏[9]的方法分別進行膠粒脫色、膠粒脫水、還原烷基化、酶切、肽段提取、質(zhì)譜檢測、數(shù)據(jù)庫檢索。

1.3.5 酪蛋白水解產(chǎn)物活性分析

酪蛋白水解活力肽的制備:制備10 g/100 mL的酪蛋白酸鈉溶液,按照蛋白酶LB-1與酪蛋白1 000 U/g比例添加蛋白酶LB-1,并在最適pH值和溫度下進行水解。分別水解0、1、3、6、12 h后沸水浴10 min終止酶促反應(yīng)。10 000 r/min離心15 min,靜置后收集上清液,-20 ℃保存,待進一步分析[10]。

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

取1 mL水解產(chǎn)物上清液樣品與2 mL 0.2 mmol/L DPPH-甲醇溶液混合,室溫下避光反應(yīng)1 h,10 000 r/min離心10 min,取上清液,測定517 nm波長處的吸光度。空白組以等體積甲醇代替DPPH溶液,對照組以等體積無菌水代替樣品。

1.3.5.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

采用ABTS陽離子自由基測定試劑盒。

1.3.5.3 α-淀粉酶抑制活性

多肽溶液對α-淀粉酶抑制作用分析依據(jù)Eleazu等[11]的方法進行。25 μL多肽樣品與25 μL含α-淀粉酶(0.5 mg/mL)的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L,pH 6.9)混合,25 ℃反應(yīng)10 min,加入25 μL含0.5 g/100 mL淀粉的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L,pH 6.9),25 ℃反應(yīng)10 min,加入50 μL 196 mmol/L二硝基水楊酸顯色劑,反應(yīng)混合物沸水浴10 min,冷卻至室溫,測定540 nm波長處的吸光度。

1.3.5.4 α-葡萄糖苷酶抑制作用

5 μL α-葡萄糖苷酶溶液(1.0 U/mL)、20 μL多肽溶液與165 μL磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mmol/L,pH 6.8)混合,在96 孔板中37 ℃反應(yīng)10 min,加入10 μL含0.95 mmol/L對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷的磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 6.9),37 ℃反應(yīng)10 min,加入100 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。測定405 nm波長處的吸光度。

1.3.5.5 鈣離子、鋅離子螯合能力測定

取等體積的多肽溶液和0.25 mol/L氯化鈣溶液混合,用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液將反應(yīng)混合物調(diào)整為pH 6.0～7.5。然后將溶液在45 ℃、80 r/min的水浴搖床中孵育1 h,充分反應(yīng)[12]。將螯合物加入9 倍體積的乙醇沉淀,6 000 r/min、4 ℃離心15 min,取上清液使用乙二胺四乙酸顯色滴定法測定螯合能力。鈣螯合使用鉻黑T作為指示劑,鋅螯合使用二甲酚橙作指示劑。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均采用3 次平行實驗取平均值,使用SPSS軟件進行方差分析,P＜0.05,差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對蛋白酶LB-1水解活力的影響

2.1.1 溫度和pH值的影響

由圖1A可以看出,水解活力在27～62 ℃之間呈現(xiàn)出先緩慢上升再驟降的趨勢,在62 ℃時蛋白水解活力降至最低26.2 U/mL。原因可能是高溫改變了酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu),使蛋白酶活性受到影響而導(dǎo)致其水解活力迅速降低。在52 ℃時,蛋白水解活力達到最大值46.49 U/mL,且溫度低于55 ℃時,蛋白酶LB-1具有較好的熱穩(wěn)定性。由圖1B可知,當(dāng)pH值在5.5～6.0范圍變化時,蛋白水解活力隨著pH值增加快速上升,在pH值大于7.0時,蛋白水解活力稍有下降之后趨于平緩。說明此酶在弱酸性的條件下(pH 6.0～7.0)擁有較高的蛋白水解活力。己有研究表明,不同來源的微生物蛋白酶最適溫度和pH值有所不同。地衣原體5A1蛋白酶[13]在pH 5.5、70 ℃時蛋白水解活力較高;枯草芽孢桿菌蛋白酶[14]在pH 6.0和60 ℃時具有最佳的水解活力;糞腸球菌2495L[15]的最佳水解溫度在50 ℃,pH值在8.0～9.0。

圖1 溫度（A）和pH值（B）對甲醇芽孢桿菌LB-1蛋白酶水解活力的影響Fig. 1 Effect of temperature and pH on proteolytic activity of LB-1

2.1.2 添加物的影響

在金屬離子、有機試劑、變性劑、洗滌劑等添加物存在的條件下,蛋白酶LB-1的穩(wěn)定性如表1所示。大部分添加物,如單價陽離子(K+、Na+、Li+)、部分二價陽離子(Zn2+、Mg2+、Ca2+)、甲醇、乙醇、乙腈、二甲基亞砜、尿素、非離子去污劑曲拉通-100溶液,對蛋白酶活性影響較小,相對水解活力均保持在95%以上,沒有明顯的抑制作用。少數(shù)添加物對蛋白酶水解活力影響較大,如Cu2+使相對活力微弱降低至92.23%;異丙醇使酶的相對活力降低至82.13%;而重金屬離子(Cd2+、Pb2+)、陰離子洗滌劑SDS尤其是Pb2+和SDS幾乎使酶失活,蛋白酶的相對水解活力僅剩10%左右。

上述結(jié)果表明Cu2+對該蛋白酶水解活力產(chǎn)生了負面影響,但不是該蛋白酶的高效抑制劑。Eltanboly等[16]發(fā)現(xiàn)Cu2+抑制毛霉QM436蛋白酶活力程度也比較低,但蛋白酶LB-1受到的抑制作用更小。異丙醇能夠破壞蛋白質(zhì)周圍的水結(jié)構(gòu),改變酶的中心構(gòu)象,從而引起蛋白質(zhì)功能的改變。重金屬離子可能會破壞酶的構(gòu)象,引起活性的大幅度改變。洗滌劑對蛋白質(zhì)的影響取決于洗滌劑和蛋白質(zhì)兩者的性質(zhì)以及環(huán)境條件[17],兩種表面活性劑對酶活性的影響差異明顯,可能的原因是對酶的界面性質(zhì)改變情況不同,從而對酶的催化功能產(chǎn)生了不同的影響。

表1 不同添加物對甲醇芽孢桿菌LB-1蛋白酶水解活力的影響Table 1Effects of different additives on proteolytic activity of LB-1

2.2 蛋白酶LB-1對乳清蛋白和酪蛋白的水解作用對比

圖2 甲醇芽孢桿菌LB-1蛋白酶對乳清蛋白和酪蛋白的水解作用Fig. 2 Hydrolysis ef ficiency of whey and caseins by LB-1

如圖2A、B所示,在水解開始后的360 min內(nèi),乳清蛋白和酪蛋白的pH值均不斷降低,分別由最初的6.52和6.66降至6.39和6.33。前30 min的pH值下降迅速,之后趨于緩慢。乳清蛋白的ORP在水解時間內(nèi),呈現(xiàn)先降低后緩慢升高的趨勢,并于水解第140分鐘時達到最低點(91.45 mV)。酪蛋白的ORP則呈現(xiàn)出先迅速下降,再快速上升的趨勢,在水解第50分鐘時達到最低值(137.86 mV),最終ORP值(172.64 mV)與初始值(176.88 mV)相差不大。

蛋白水解過程中,pH值和ORP的變化可能會影響到帶電分子的電離狀態(tài),從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和蛋白酶的活性,因而會影響到蛋白水解程度[18]。蛋白酶LB-1在水解蛋白過程中pH值降低,可能是由于蛋白質(zhì)水解生成氨基酸殘基,在溶液中產(chǎn)生了游離的氫離子,這也是水解前期ORP變化迅速的可能原因。以酪蛋白為底物時,蛋白水解過程中pH值和ORP變化程度均大于乳清蛋白,說明該酶對酪蛋白的水解程度大于乳清蛋白。

如圖2C所示,蛋白酶LB-1對乳清蛋白水解360 min內(nèi)均未產(chǎn)生明顯小于10 kDa的水解產(chǎn)物,隨著時間的延長略有水解,但作用不明顯。改變蛋白酶LB-1質(zhì)量濃度后,對乳清蛋白水解過程SDS-PAGE分析的結(jié)果(圖2E)顯示,各電泳條帶依舊無明顯變化。

如圖2D所示,隨著水解時間延長,酪蛋白條帶逐步消失,水解產(chǎn)物豐富。水解120 min后(第6泳道),25～30 kDa的酪蛋白基本水解完全,水解360 min后(第8泳道)基本只有水解產(chǎn)物存在。位于10～15 kDa和小于10 kDa的水解產(chǎn)物從水解5 min后(第2泳道)開始出現(xiàn),含量隨著時間延長逐步增加。從第120分鐘開始出現(xiàn)了分子質(zhì)量更小的水解產(chǎn)物,并在水解360 min后產(chǎn)量達到最大值。改變蛋白酶LB-1質(zhì)量濃度(圖2F),酪蛋白的水解程度隨著酶質(zhì)量濃度上升而逐步增大,在5 mg/mL(第6泳道)的酶質(zhì)量濃度下,水解產(chǎn)物大量生成,在酶質(zhì)量濃度增加至10 mg/mL(第7泳道)時,底物被完全水解。當(dāng)酶質(zhì)量濃度增加至20 mg/mL(第8泳道)時,大部分水解產(chǎn)物也會被進一步分解。

蛋白酶LB-1對乳清蛋白的水解作用并不明顯,不同酶質(zhì)量濃度下各泳道的蛋白條帶沒有明顯變化,表明蛋白酶LB-1對乳清蛋白的水解活力比較低,且提高酶質(zhì)量濃度也不能有效提高乳清蛋白水解程度;而絕大部分酪蛋白經(jīng)過180 min己被水解完,說明酪蛋白擁有蛋白酶LB-1的多個水解位點,數(shù)量遠大于乳清蛋白,且隨著酶質(zhì)量濃度的增大,酪蛋白的水解程度逐步增大,表明分解酪蛋白產(chǎn)生的肽段當(dāng)中依舊存在酶的水解位點。與此結(jié)果相類似的是,Jiang等[19]從糯米酒中分離的微生物蛋白酶同樣水解酪蛋白的程度顯著大于乳清蛋白。因此本研究選取3 種酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進行了進一步水解分析,以探究該酶具體的作用蛋白。

2.3 蛋白酶LB-1對不同酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的水解作用對比

圖3 不同蛋白酶質(zhì)量濃度下酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的水解Fig. 3 Hydrolysis efficiency of individual caseins by the protease at different concentrations

隨著蛋白酶質(zhì)量濃度從0 mg/mL增加到1 mg/mL,β-酪蛋白無明顯變化(圖3B),所有條帶均與0 mg/mL時保持一致,α-酪蛋白(圖3A)和κ-酪蛋白(圖3C)水解明顯。在1 mg/mL(第8泳道)的質(zhì)量濃度下,α-酪蛋白和κ-酪蛋白幾乎水解完全,對應(yīng)條帶消失。但是α-酪蛋白的水解產(chǎn)物穩(wěn)定性較差,在1 mg/mL(圖3B第8泳道)的酶質(zhì)量濃度下產(chǎn)物降解為更小的肽段,對應(yīng)條帶消失。κ-酪蛋白(圖3C)在較低酶質(zhì)量濃度0.031 25 mg/mL時(圖3C第2泳道)產(chǎn)生了一條明顯的蛋白水解條帶,分子質(zhì)量大小約為11 kDa。

上述結(jié)果表明,LB-1蛋白酶對β-酪蛋白的水解不敏感,對α-、κ-酪蛋白的水解具有較高的活性,這與來源于糞腸球菌TUA2495L[15]和雞樅菌MTCC5091[20]的微生物蛋白酶的水解特性一致。但是α-酪蛋白的水解產(chǎn)物穩(wěn)定性較差,只有κ-酪蛋白具有存在于整個水解過程的水解產(chǎn)物,說明該蛋白條帶為蛋白酶LB-1水解κ-酪蛋白的主要水解產(chǎn)物。由于該條帶與凝乳酶使牛乳凝乳后所產(chǎn)生的副κ-酪蛋白分子質(zhì)量接近(12.268 kDa),該主要肽段的生成很有可能是蛋白酶LB-1具有凝乳作用的關(guān)鍵。因此對κ-酪蛋白進行進一步的水解位點分析。

2.4 蛋白酶LB-1對κ-酪蛋白的水解位點分析

表2 胰蛋白酶處理顯示的κ-酪蛋白序列片段Table 2 Peptide fragments of κ-casein treated with trypsin

將蛋白酶LB-1水解κ-酪蛋白得到的主要肽段(約11 kDa)用胰蛋白酶酶解,將酶解片段進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜指紋圖譜分析,結(jié)果如表2所示。胰蛋白酶酶解得到12 條肽段,所有肽段均以賴氨酸或精氨酸結(jié)尾,符合胰蛋白酶的水解規(guī)律。從圖4可以看出,κ-酪蛋白裂解出的主要肽段中,多肽肽段序列從κ-酪蛋白氨基端的第22位異亮氨酸開始,到第112位的賴氨酸結(jié)束,且未檢測到113位的天冬氨酸殘基,表明蛋白酶LB-1對κ-酪蛋白的水解位點主要有2 個,分別為Lys21-Ile22和Lys112-Asn113。這個主肽含有90 個氨基酸,分子質(zhì)量為10.537 kDa,這與凝膠電泳分析(圖3C)的大小一致。

圖4 κ-酪蛋白的主要裂解位點分析Fig. 4 Analysis of the key cleavage sites of κ-casein

近年來多種植物與微生物來源的蛋白酶對κ-酪蛋白水解位點相繼被報道,生姜源蛋白酶[21]的水解位點位于Ala90-Glu91和His102-Leu103,中華獼猴桃源蛋白酶[22]的水解位點為Arg97-His98或Lys111-Lys112,向日葵種子提取物凝乳酶[23]和雞樅菌MTCC5091蛋白酶[20]的水解位點均為Phe105-Met106,合歡種子提取物凝乳酶[23]的水解位點為Lys116-Thr117。不同來源的蛋白酶對κ-酪蛋白的水解位點有所差異,但這些主要水解位點的斷裂,均可產(chǎn)生一定的凝乳作用。

2.5 蛋白酶LB-1水解酪蛋白的產(chǎn)物活性分析

2.5.1 酪蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性分析

圖5 酪蛋白水解產(chǎn)物的生物活性Fig. 5 Bioactivity of casein hydrolysates

如圖5A所示,水解0 h的酪蛋白具有62.58%的DPPH自由基清除率,在水解的前6 h,DPPH自由基清除能力隨著酪蛋白水解程度的升高而逐步升高,達到最大清除率75.4%,上升了12.81%。在第9小時趨于穩(wěn)定,第12小時略有降低。清除率下降的原因可能是水解12 h幾乎己無酪蛋白存在,部分具有活性的產(chǎn)物也水解成了更短的肽段,消減了其抗氧化的能力。如圖5B所示,各水解產(chǎn)物的ABTS陽離子自由基清除率較第0小時均有升高,其中3～9 h清除率穩(wěn)定在42%左右,第12小時到最大值48.45%,清除率相對升高了13.75%。

DPPH法和ABTS法均為常用的測定抗氧化功能的方法,國內(nèi)外己有眾多研究。高婷等[24]通過優(yōu)化AS1398中性蛋白酶水解酪蛋白的條件,使酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達到了80.43%。韓娜等[25]通過分離純化肽段,得到與酪蛋白酶解液DPPH自由基清除率差異顯著的結(jié)果。Mohamed[26]以牛乳和水牛乳為底物,得到的水解產(chǎn)物ABTS陽離子自由基清除率在34.12%～58.44%之間,這與本實驗的結(jié)果類似。

2.5.2 酪蛋白水解產(chǎn)物降血糖活性分析

由圖5C可知,蛋白酶LB-1水解酪蛋白所有時間段的酶抑制率均在70%以上,能夠起到良好的酶抑制作用。加入蛋白酶后,不同水解時間產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率均有不同程度的升高,第1小時和第6小時的抑制率最高,均在80.89%,相對增高了7.65%。α-葡萄糖苷酶的抑制率(圖5D)在第0小時只有13.81%,水解開始后,抑制率迅速上升,3 h后水解程度和α-葡萄糖苷酶抑制率不斷升高,在第12小時達到最大值93.12%,相比第0小時上升了79.31%。經(jīng)水解后的酪蛋白相比第0小時未水解酪蛋白的α-葡萄糖苷酶抑制率均有明顯增加,說明蛋白酶LB-1水解酪蛋白產(chǎn)生的多肽對α-葡萄糖苷酶的抑制作用十分明顯,且肽段越小抑制作用越強。

抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性能夠降低餐后血糖水平,減緩淀粉的消化與分解,這對II型糖尿病患者和邊緣性糖尿病患者具有積極作用[27]。目前己有類似研究發(fā)現(xiàn),酪蛋白水解產(chǎn)生的含有7 個氨基酸殘基的寡肽(YPFPGPI)[28]能夠抑制小腸對葡萄糖的吸收從而達到降血糖的目的[29]。

2.5.3 酪蛋白水解產(chǎn)物金屬螯合活性分析

如圖5E所示,第3小時和第12小時的鈣離子螯合率在40%以下,其他時間水解產(chǎn)物螯合率都在55%以上,第9小時螯合率最高達到63.13%,第12小時最低只有36.27%。鋅離子螯合率(圖5F)與鈣離子的趨勢相類似,但螯合率均比鈣離子低。水解第0小時的螯合率(33.26%)僅次于第9小時(35.31%),第12小時最低為25.83%。

鈣離子、鋅離子的螯合需要多肽上特定的氨基酸序列或者氨基酸殘基提供的結(jié)合位點,12 h的長時間水解己經(jīng)使大部分水解產(chǎn)物多次水解,僅剩小分子肽段,造成與金屬螯合率降低。而對于0 h的酪蛋白而言,其本身就具備一定的金屬結(jié)合能力[30],且大分子的蛋白結(jié)構(gòu),亦有可能會對金屬離子進行掩埋,從而造成螯合率較高的現(xiàn)象。但是,酪蛋白在腸胃進行消化時,會失去原有結(jié)構(gòu)以及序列,導(dǎo)致螯合的金屬離子無法被腸道直接吸收利用,而無法達到金屬補充劑的目的。

3 結(jié) 論

本研究測定了甲醇芽孢桿菌蛋白酶LB-1在不同溫度、pH值、添加物條件下的水解活力,結(jié)果表明該蛋白酶最適水解溫度為52 ℃,最適pH值為6.0～7.0,對大部分金屬離子、有機試劑、變性劑和洗滌劑表現(xiàn)出了較高的穩(wěn)定性。

分別以乳清蛋白和酪蛋白為底物進行的水解實驗表明,蛋白酶LB-1對乳清蛋白的水解不明顯,但對酪蛋白水解作用顯著。以α-、β-、κ-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作為底物進行的水解實驗進一步表明,該酶對κ-酪蛋白具有較高的水解活力和水解產(chǎn)物穩(wěn)定性,水解位點主要位于Lys21-Ile22和Lys112-Asn113,得到分子質(zhì)量為10.537 kDa的主要肽段。

對蛋白酶LB-1在最適條件下水解酪蛋白的產(chǎn)物進行生物活性分析,結(jié)果表明其DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除率分別可達75.4%和48.45%,α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的最高抑制率分別為80.89%和93.12%,鈣離子和鋅離子的最高螯合率分別為63.13%和35.31%;表明該酶具有一定的抗氧化能力和降血糖作用,以及良好的金屬離子螯合能力。甲醇芽孢桿菌蛋白酶LB-1水解酪蛋白的產(chǎn)物可作為新型功能性食品配料,在功能性干酪加工和乳源活性肽開發(fā)方面具有潛在的應(yīng)用價值。