Grp78基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建和包裝及鑒定＊

李亞文，徐世元，張慶國(guó)，李 樂(lè)，賴(lài)露穎，鄭 艇，蘇嬌玲，楊耐梅，李元濤

（1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院麻醉科，廣州 510282；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院麻醉科，廣東深圳 518028）

長(zhǎng)期以來(lái)，過(guò)表達(dá)microRNA質(zhì)粒可直接用于細(xì)胞系轉(zhuǎn)染表達(dá)，是研究基因功能的重要方法。但用真核細(xì)胞構(gòu)建的表達(dá)載體在細(xì)胞轉(zhuǎn)染階段存在轉(zhuǎn)染率不高且周期長(zhǎng)等弊端，限制其廣泛應(yīng)用；而慢病毒載體是以人類(lèi)免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，它既能感染分裂細(xì)胞又能感染非分裂細(xì)胞，安全性高并可以在體內(nèi)較長(zhǎng)期地表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)所用慢病毒載體感染目的細(xì)胞后不再感染其他細(xì)胞，也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。

本研究通過(guò)構(gòu)建Grp78基因過(guò)表達(dá)慢病毒表達(dá)載體，為下一步感染SH－SY5Y細(xì)胞株，進(jìn)而研究Grp78在布比卡因神經(jīng)毒性所致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞損傷中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）主要試劑：瓊脂糖、PCR試劑盒、Taq polymerase，dNTP、限制性?xún)?nèi)切酶、質(zhì)粒抽提試劑盒。臺(tái)盼藍(lán)、胰酶、DMSO、DMEM、Lipofectamine 2000、細(xì)胞株：293T；菌株：大腸埃希菌菌株DH5α；病毒載體：GV 載體、pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體。（2）主要儀器：PCR儀、穩(wěn)壓DNA電泳儀、凝膠成像儀、培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)、熒光顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增目的基因 （1）載體信息：GV261；元件順序：Ubi－MCS－IRES－Cherry；克隆位點(diǎn)：AgeI／NheI。（2）目的基因片段Grp78引物，上游：5′－CGG GTA CCG GTC GCC ACC ATG AAG CTC TCC CTG GTG G－3′；下 游：5′－AGT CGC TAG CCT ACA ACT CAT CTT TTT CTG CTG TAT C－3′。

1.2.2 制備感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化 CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟如下：（1）各取每種感受態(tài)細(xì)胞懸液200μL轉(zhuǎn)移至無(wú)菌微量離心管中，每管加入連接液10μL，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻，然后置冰中放置30min。制備感受態(tài)細(xì)胞，使其具有攝取外源DNA的能力。（2）42℃熱休克90s。快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中冷卻細(xì)胞1～2min。每管加入800μL LB培養(yǎng)基。水浴加溫至37℃，然后放置搖床溫育45min以復(fù)蘇細(xì)菌。（4）將150μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到AMP（100μg／mL）抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基上。把平板置于室溫直至液體被吸收。然后倒置平皿，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。（5）克隆進(jìn)行后續(xù)PCR鑒定。

1.2.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 PCR產(chǎn)物連接入線性化表達(dá)載體反應(yīng)體系見(jiàn)表1，反應(yīng)條件 ：25℃30min；42℃15min。

1.2.4 Lentivirus病毒包裝 消化293T細(xì)胞，調(diào)整其密度為每20mL有1.2×107個(gè)細(xì)胞，接種細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，放置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞狀態(tài)對(duì)于病毒包裝至關(guān)重要，需要保證良好的細(xì)胞狀態(tài)和較少的傳代次數(shù)。轉(zhuǎn)染前2h將含胎牛血清培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。向一離心管中加入制備的各DNA溶液（pGC－LV 載 體20μg、pHelper 1.0 載體15μg、pHelper 2.0載體10μg）與相應(yīng)體積培養(yǎng)基混合均勻，調(diào)整總體積為2.5mL，室溫下溫育5min。將Lipofectamine 2000試劑輕柔搖勻，取100μL Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4mL Opti－MEM培養(yǎng)基混合，室溫下溫育5min。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進(jìn)行混合，輕顛混勻，避免振蕩，且須5min內(nèi)混合?；旌虾笫覝叵聹赜?0min，然后將混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，混合均勻，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8h后倒去培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20mL磷酸鹽緩沖液（PBS），以洗滌殘余混合液，移去混合液。每瓶細(xì)胞中加入含10% 胎牛血清培養(yǎng)基25mL，放置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2d。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.2.5 Lentivirus滴度測(cè)定

1.2.5.1 樣品制備 293T細(xì)胞傳代，24孔中每個(gè)孔加入1×105個(gè)細(xì)胞，體積為500μL；次日準(zhǔn)備10個(gè)無(wú)菌Ep管，每管中加90μL培養(yǎng)基；取待測(cè)病毒原液10μL加入到第一個(gè)管中，混合均勻，取混合均勻的第一管液10μL加入到第二個(gè)管中繼續(xù)相同的操作直到最后一管；選取所需細(xì)胞孔，吸去90μL培養(yǎng)基。加稀釋好的病毒溶液，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；1d后，加入新鮮培養(yǎng)基500μL。小心操作；4d后抽提RNA。

1.2.5.2 總RNA抽提 去細(xì)胞上清液，每孔加入1mL Trizol，吹打，室溫靜置5min，轉(zhuǎn)移至另一新1.5mL Ep管中。每管加200μL氯仿，用力震蕩15s，室溫下靜置15min。4℃下12000r／min離心15min。從每管中吸取上清液至另一新1.5 mL Ep管中。加入等體積－20℃預(yù)冷的異丙醇，混勻后－20℃沉淀10min。4℃下12000r／min離心10min，移去上清液。加入1mL 4℃預(yù)冷的75%乙醇，洗滌沉淀及離心管壁。4℃下10000r／min離心5min，移棄上清液。4℃下10000 r／min再次離心5min，吸去殘液，室溫下干燥，不需完全干燥。加20μL無(wú)RNA酶（RNase）水至完全溶解，紫外分析測(cè)定所抽提RNA濃度。

1.2.5.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄獲cDNA 將1μL Oligo dT（0.5μg／μL）和2.0μg總RNA加入PCR小管，補(bǔ)焦碳酸二乙酯（DEPC）水至9μL?；旌暇鶆?、離心，70℃溫浴10min。緊接著插入到0℃冰水浴中。按下表比例，根據(jù)反應(yīng)管數(shù)算出所需試劑量。將M－MLV酶等在冰上混勻得到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。在每個(gè)反應(yīng)管中加11μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，混合均勻后離心。其中，11μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液含5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL、10mmol／L dNTPs 2μL、RNA 抑制劑 0.5μL、M－MLV－RTase 1μL、DEPC水3.5μL。在42℃進(jìn)行1h完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，后用70℃處理10min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA可用于PCR，也可－80℃長(zhǎng)期保存。

1.2.5.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 實(shí)時(shí)定量PCR在Takara的TP800PCR儀上完成。配置反應(yīng)體系：每管加入SYBR premix ex Taq 10μL、上游引物（5μmol／L）1.0μL、下游引物（5μmol／L）1.0μL、cDNA 1.0μL、ddH2O 7.5μL。設(shè)定程序?yàn)閮刹椒▽?shí)時(shí)定量PCR。預(yù)變性95℃5s；變性95℃5s，退火60℃30s，延伸60℃30s，40個(gè)循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值，用于制作熔解曲線。PCR結(jié)束后，在95℃變性1 min。然后冷卻至55℃，使DNA雙鏈充分聚合。從55℃開(kāi)始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s，同時(shí)讀取吸光值。兩個(gè)循環(huán)后將調(diào)定點(diǎn)升高0.5℃。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大?。?10 bp，見(jiàn)圖1。

圖1 PCR鑒定轉(zhuǎn)化結(jié)果電泳圖

2.2 病毒的收獲及濃縮 收集轉(zhuǎn)染后2d的293T細(xì)胞上清液。4℃、4000×g離心10min，以除去細(xì)胞碎片。用0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾上清液到40mL超速離心管中。把病毒粗提液樣品加入過(guò)濾杯中。將過(guò)濾杯插到濾過(guò)液收集管中，再4000×g離心至所需病毒濃縮體積，時(shí)間15min。離心結(jié)束后取出離心裝置，將過(guò)濾杯和濾過(guò)液收集杯分開(kāi)。將過(guò)濾杯倒扣在樣品收集杯上，離心力不超過(guò)1000×g，時(shí)間2min。過(guò)高轉(zhuǎn)速會(huì)使樣品損失。把過(guò)濾杯從樣品收集杯上移開(kāi)。樣品收集杯中即為病毒濃縮液。將病毒濃縮液移出，進(jìn)行分裝；取其中一支進(jìn)行滴度測(cè)定，其余置－80℃長(zhǎng)期保存。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定綠色熒光蛋白標(biāo)記的慢病毒滴度

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR曲線圖

2.3.1 引物信息 綠色熒光蛋白（GFP）引物：被擴(kuò)增的片段位于211～496bp之間，其上游引物序列為5′－TGC TTC AGC CGC TAC CC－3′，熔點(diǎn)Tm為57.4℃，GC百分含量為64.7%。下游引物序列為5′－AGT TCA CCT TGA TGC CGT TC－3′，熔點(diǎn)Tm為57.3℃，GC百分含量為50.0%。β－actin被擴(kuò)增的片段位置位于932～1233bp之間，其上游引物序列為5′－GTG GAC ATC CGC AAA GAC－3′，熔點(diǎn) Tm 為52.6℃，GC百分含量為55.6%。下游引物序列為5′－AAA GGG TGT AAC GCA ACT A－3′，熔點(diǎn)Tm為51.0℃，GC百分含量為42.1%。

2.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果 在該次病毒滴度檢測(cè)中，1.00E－03μL組樣品與對(duì)照組樣品的Ct值差異大于3以上，故認(rèn)定病毒顆粒存在于1.00E－03μL組樣品中。見(jiàn)圖2。

2.4 β－actin、GFP熔解曲線 見(jiàn)圖3。

圖3 β－actin、GFP熔解曲線

3 討 論

通過(guò)慢病毒載體的構(gòu)建、包裝，得到穩(wěn)定表達(dá)的質(zhì)粒；該質(zhì)粒能有效應(yīng)用于研究Grp78基因過(guò)表達(dá)來(lái)減少細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［1］。該質(zhì)粒較采用真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染得到的質(zhì)粒感染細(xì)胞的成功率高［2－3］。觀察 GFP表達(dá)情況［4－5］，在加入 1E－5μL病毒原液的孔中觀察到3個(gè)細(xì)胞存活，說(shuō)明該孔中至少有3病毒顆粒感染細(xì)胞，且認(rèn)為該病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量。在加入1E－6μL病毒原液的孔中觀察到2個(gè)帶有熒光的細(xì)胞，說(shuō)明該孔中至少有2個(gè)病毒顆粒感染細(xì)胞，且認(rèn)為該病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量，即2／（1E－6）＝2E＋6，單位為 TU／μL，也就等于2E＋9 TU／mL。

加入不同病毒量的細(xì)胞樣品，通過(guò)提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，通過(guò)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的Ct值差異來(lái)判斷滴度值。通常情況下認(rèn)為Ct值差異2以上存在顯著差異［6］。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所獲得20μL cDNA中只取1μL用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，該結(jié)果僅表示1／20樣品的情況，所以在滴度計(jì)算時(shí)乘以系數(shù)20。

退火溫度偏低，可引起非特異性擴(kuò)增。適當(dāng)提高退火溫度可降低非特異性擴(kuò)增。故通過(guò)測(cè)量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。非特異性條帶的出現(xiàn)，原因諸多，引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體、退火溫度過(guò)低、PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多等。針對(duì)解決措施有降低引物量、減少循環(huán)次數(shù)、適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。熔解曲線中，由于SYBR GreenⅠ與所有雙鏈DNA相結(jié)合，引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量精確性。故由熔解曲線來(lái)分析產(chǎn)物的均一性更有助于準(zhǔn)確分析SYBR Green實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果［7－13］。

設(shè)立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，注意交叉污染可能。每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。PCR結(jié)束后，根據(jù)發(fā)生過(guò)程中熒光值變化繪出每個(gè)樣品的熔解曲線。熔解曲線是擴(kuò)增反應(yīng)的質(zhì)控途徑，圖中沒(méi)有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬，表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。不同的擴(kuò)增產(chǎn)物因?yàn)槠溟L(zhǎng)度和GC含量不同而在不一樣的溫度下解鏈，當(dāng)產(chǎn)物解鏈時(shí)，SYBR GreenⅠ的熒光值將降低并被儀器所監(jiān)測(cè)。繪制熔解曲線時(shí)，需實(shí)時(shí)定量PCR儀連續(xù)監(jiān)測(cè)每個(gè)樣品在從雙鏈完全配對(duì)到完全解鏈的升溫過(guò)程中熒光值的變化，由此繪制出熒光強(qiáng)度隨溫度變化的負(fù)一次倒數(shù)圖。熒光強(qiáng)度變化的拐點(diǎn)（熔點(diǎn)，Tm）即為熔解峰值。Grp78過(guò)表達(dá)病毒載體的構(gòu)建和包裝成功，為今后研究Grp78基因在布比卡因所致神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為布比卡因神經(jīng)毒性的防治打開(kāi)一扇科學(xué)之門(mén)。

［1］李亞文，徐世元，張慶國(guó)，等.高糖環(huán)境誘導(dǎo)SH－SY5Y細(xì)胞ROS爆發(fā)－內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強(qiáng)布比卡因神經(jīng)毒性［D］.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

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