NOD8對H2O2誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞凋亡的影響*

鄭媛媛， 楊文欣， 周 晗， 胡巢鳳

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國家中醫(yī)藥管理局病理生理實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

細(xì)胞凋亡是一系列信號(hào)分子精密調(diào)控的程序性死亡過程，由特定基因控制的細(xì)胞自主、有序的死亡。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激通過影響相關(guān)酶類的功能，破壞細(xì)胞膜完整性，干擾細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，從而引起細(xì)胞的凋亡，甚至壞死。H2O2作為一種氧化劑，干擾細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1]。

近年研究發(fā)現(xiàn)NOD樣受體(NOD-like receptors, NLRs)為胞漿內(nèi)的模式識(shí)別受體，目前在人類已發(fā)現(xiàn)20多個(gè)NLRs家族成員，主要含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為一個(gè)C末端富含亮氨酸的重復(fù)序列、位于中央的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和N末端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域。而NOD8 (也稱為PYNOD) 與之不同的是C末端缺乏作為配體識(shí)別區(qū)域的富含亮氨酸的重復(fù)序列，N末端為PYD結(jié)構(gòu)域以及位于中央的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)[2-5]。Imamura等[6]研究發(fā)現(xiàn)NOD8可抑制凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)介導(dǎo)的NF-κB的活化和細(xì)胞凋亡，但其抗凋亡機(jī)制尚不清楚。Caspase-3作為凋亡效應(yīng)蛋白在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中具有重要作用。為進(jìn)一步探討NOD8在細(xì)胞凋亡中的作用, 本研究主要觀察NOD8對H2O2誘導(dǎo)人肝細(xì)胞L02凋亡的影響及可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞、質(zhì)粒與主要試劑

人肝細(xì)胞L02由中山大學(xué)惠贈(zèng)；pEGFP-C2為本室保存；pEGFP-NOD8真核表達(dá)質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建。

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、PBS、含0.25% EDTA的胰酶為Gibco產(chǎn)品；胎牛血清購自BI；細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用的陽離子聚合物JetPRIME為Polyplus產(chǎn)品； Annexin V-PE/7-AAD和caspase-3活性檢測試劑盒購自Biovision；BCA蛋白定量試劑盒為上海申能博彩生物公司產(chǎn)品；NOD8多克隆抗體購自Santa Cruz；HRP標(biāo)記的兔Ⅱ抗購自CST；Hoechst 33342、硝酸纖維素膜(Millipore)、濾紙、考馬斯藍(lán)R-250、Tween-20、牛血清白蛋白、脫脂奶粉和SDA-PAGE試劑盒均購自碧云天公司；其它生化試劑均為分析純產(chǎn)品。

2 主要實(shí)驗(yàn)方法

2.1MTT法檢測不同濃度H2O2對細(xì)胞活性的影響 將L02細(xì)胞以1×104cells/well 鋪于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)與實(shí)驗(yàn)平行的本底對照孔，分別加入0.2、 0.4、 0.6、0.8、1和2 mmol/L 濃度的H2O2。6 h后每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h后，棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO振蕩10 min，待藍(lán)色顆粒完全溶解后，酶標(biāo)儀 (Thermo Scientific) 檢測波長為570 nm的吸光度值(Avalue)。

2.2L02細(xì)胞培養(yǎng)及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 采用10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，并加入1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素，在37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及傳代。L02細(xì)胞按1×108/L分別接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長至75%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為3組：pEGFP-C2組(pEGFP-C2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞)；pEGFP-C2+H2O2組(pEGFP-C2轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，加1 mmol/L H2O2繼續(xù)培養(yǎng)6 h)；pEGFP-NOD8+H2O2組(pEGFP-NOD8轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，加1 mmol/L H2O2繼續(xù)培養(yǎng)6 h)。將JetPRIME/DNA復(fù)合物加入培養(yǎng)板，上下輕搖混勻，然后放置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后相應(yīng)組加1 mmol/L H2O2繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

2.3Western blotting檢測NOD8蛋白表達(dá) 收集(1～5)×106L02細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加60 μL的細(xì)胞裂解液，冰上孵育30 min，離心15 min，收集上清。Bradford法檢測蛋白濃度，加入5×loading buffer 加熱變性，用SDS凝膠電泳，5% 濃縮膠、10%分離膠分離蛋白后，將蛋白通過電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上，用特異性抗體檢測NOD8蛋白表達(dá)，以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白內(nèi)參照。

2.4Hoechst 33342染色法檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h, 棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次，用4%的多聚甲醛固定30 min之后，用PBS洗滌2次，吸盡液體，加入0.5 mL Hoechst 33342染色液，染色15 min后于熒光顯微鏡下觀察。激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為460 nm左右。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞在(1～5)×106個(gè)以內(nèi)。PBS洗滌細(xì)胞2次，加200 μL 1× binding buffer重懸細(xì)胞，用Annexin V-PE/7-AAD染色后流式細(xì)胞儀檢測。加5 μL Annexin V-PE ，室溫孵育15 min；再用1×binding buffer洗滌細(xì)胞2次，200 μL 1×binging buffer重懸細(xì)胞，加5 μL 7-AAD viability staining solution，4 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。

2.6比色法測定caspase-3活性 按照2.2法分組，L02肝細(xì)胞培養(yǎng)6 h后，消化、離心、收集各組細(xì)胞。用50 μL的細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，冰上孵育10 min, 再加入96孔板中, 每孔依次加入含10 mmol/L DTT的2×reaction buffer 50 μL，及1 mmol/L YVAD-AFC substrate 5 μL，隨后放置于37 ℃溫箱孵育1～2 h，酶標(biāo)儀400 nm激發(fā)波長，505 nm發(fā)射波長下測定各孔的A值。計(jì)算每一種樣品蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化校正后的A值；將該值與對照組(pEGFP-C2組)A值相比，計(jì)算出各組細(xì)胞樣品中caspase-3的相對活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析和處理。計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，各組方差齊時(shí)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)；各組方差不齊時(shí)，兩兩比較采用Tamhane’s T2法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度H2O2對細(xì)胞活性的影響

采取MTT法分析不同濃度的H2O2對L02細(xì)胞細(xì)胞活性的影響。與對照組相比較，0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L H2O2對細(xì)胞活性無明顯影響，(P>0.05)；1～2 mmol/L H2O2可使細(xì)胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，選擇1 mmol/L H2O2作為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的濃度(圖1)。

Figure 1. The effect of H2O2 on activity of L02 cells. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control.

2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人L02肝細(xì)胞后綠色熒光蛋白的表達(dá)情況

pEGFP-C2和pEGFP-NOD8質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白基因，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)綠色熒光，高倍鏡下計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染率約40%。Western bloting 檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-C2 空質(zhì)粒細(xì)胞有少量NOD8 蛋白表達(dá)，而轉(zhuǎn)染pEGFP-NOD8細(xì)胞NOD8 蛋白表達(dá)明顯增加，見圖2。

3 Hoechst 33342染色觀察細(xì)胞的凋亡情況

Hoechst 33342染色后，在倒置熒光顯微鏡下觀察L02細(xì)胞凋亡情況，pEGFP-C2組僅有少量細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核強(qiáng)藍(lán)色熒光現(xiàn)象；pEGFP-C2+H2O2組較多細(xì)胞出現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)色熒光細(xì)胞核，染色質(zhì)高度凝聚或呈碎塊狀，細(xì)胞凋亡增加；而pEGFP-NOD8+ H2O2組上述現(xiàn)象明顯減少，說明NOD8抑制細(xì)胞凋亡，見圖3。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測L02細(xì)胞的凋亡率

Annexin V-PE/7-AAD染色后，用流式細(xì)胞儀檢測分析L02細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，與pEGFP-C2組比較，pEGFP-C2+H2O2組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；而與pEGFP-C2+H2O2組相比，pEGFP-NOD8+ H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，見圖4。

5 過表達(dá)NOD8抑制H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞caspase-3活性

如圖5所示，與pEGFP-C2組比較，pEGFP-C2+H2O2組caspase-3活性明顯升高(P<0.01)；而與pEGFP-C2+H2O2組相比，pEGFP-NOD8+ H2O2組caspase-3活性顯著下降(P<0.05)。

Figure 2. The protein expression of EGFP and NOD8 after the plasmids transfected into L02 cells for 24 h. A: pEGFP-C2 (×200); B: pEGFP-NOD8 (×200); C: pEGFP-C2 (×400); D: pEGFP-NOD8 (×400); E: the protein expression of NOD8 detected by Western blotting.

Figure 3. The effect of NOD8 on the apoptosis of L02 cells induced by H2O2 (Hoechst 33342 staining，×400).

Figure 4. The effect of NOD8 on the apoptotic rate in L02 cells induced by H2O2. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pEGFP-C2; ## P<0.01 vs pEGFP-NOD8+H2O2.

Figure 5. The effect of NOD8 on the caspase-3 activity in L02 cells induced by H2O2 . Mean±SD. n=4. ## P<0.01 vs pEGFP-C2; *P<0.05 vs pEGFP-NOD8+ H2O2.

討 論

細(xì)胞周期作為一個(gè)有序進(jìn)行的過程，當(dāng)細(xì)胞在有序的生命活動(dòng)過程中出現(xiàn)無法被修復(fù)的嚴(yán)重DNA損傷、信號(hào)通路的紊亂及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的失態(tài)時(shí)，細(xì)胞周期被不可逆的阻滯，進(jìn)而促使細(xì)胞凋亡[7]。細(xì)胞凋亡是在個(gè)體發(fā)育生長過程中為維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、調(diào)控機(jī)體發(fā)育、具有基因編碼的細(xì)胞死亡過程，是機(jī)體對外界刺激進(jìn)行的主動(dòng)應(yīng)答，貫穿于機(jī)體的整個(gè)生命過程中[8]。由于內(nèi)源性和(或)外源性刺激使機(jī)體代謝異常而產(chǎn)生的活性氧增多, 常使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而細(xì)胞凋亡功能亢進(jìn)與組織損傷和器官功能衰竭的發(fā)病密切相關(guān)[9-10]。

NLRs在天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，我們前期研究證實(shí), NOD8可抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子[11]。國外有研究發(fā)現(xiàn), 將ASC轉(zhuǎn)染HEK293T-Y細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；但同時(shí)轉(zhuǎn)染ASC及NOD8則HEK293T-Y細(xì)胞凋亡明顯減少，NOD8可以抑制ASC介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[5], 但其抗凋亡機(jī)制尚不清楚。本研究用H2O2損傷L02 細(xì)胞作為誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的模型, 進(jìn)一步探討NOD8在細(xì)胞凋亡中的作用及可能機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)用MTT法檢測細(xì)胞活性，確定1 mmol/L H2O2為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的劑量。選擇轉(zhuǎn)染效果高、細(xì)胞毒性小的轉(zhuǎn)染試劑陽離子聚合物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒pEGFP-NOD8轉(zhuǎn)染細(xì)胞后綠色熒光蛋白及NOD8蛋白表達(dá)明顯增加，證實(shí)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成功。Hoechst 33342染色顯示，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞多數(shù)發(fā)生了細(xì)胞核呈強(qiáng)藍(lán)色，染色質(zhì)高度凝聚、濃縮邊緣化或碎塊，說明細(xì)胞凋亡增多；而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-NOD8后上述現(xiàn)象明顯改善，結(jié)果證明NOD8能抑制細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與pEGFP-C2組比較，pEGFP-NOD8組細(xì)胞凋亡率明顯增加；而重組質(zhì)粒pEGFP-NOD8轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能顯著抑制由H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說明NOD8在細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。另外，caspases家族是一組存在于胞質(zhì)溶膠中結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，都含有半胱氨酸活性位點(diǎn)，并特異斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵。Caspase-3是caspases家族成員之一，具有相近的底物和抑制劑特異性，可導(dǎo)致DNA修復(fù)的抑制并啟動(dòng)DNA的降解，從而導(dǎo)致核纖層和細(xì)胞骨架的崩解，促使細(xì)胞凋亡；caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵蛋白酶[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2可明顯增加caspase-3活性，NOD8則顯著抑制caspase-3活性。本研究從定性和定量方面說明NOD8對細(xì)胞凋亡具有抑制功效。

綜上所述，NOD8能夠抑制由H2O2誘導(dǎo)L02細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能是通過抑制caspase-3活化。隨著對NOD8抗凋亡作用的深入研究，將為臨床治療多種肝臟疾病及神經(jīng)元退行性疾病提供新的思路。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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