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    EGCG通過mTOR通路拮抗低氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡與自噬*

    2014-08-13 12:39:40曹錦霞王紅衛(wèi)
    中國病理生理雜志 2014年11期
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)細(xì)胞低氧孵育

    曹錦霞, 王 浩, 王紅衛(wèi), 游 詠

    (南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院,湖南 衡陽 421000)

    表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是茶多酚的活性成分,越來越多的研究表明,EGCG在神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)[1]、對抗氧化應(yīng)激[2]、抗炎[3]及抑制脂質(zhì)聚集[4]等多種生物學(xué)功能方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。

    雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶,不僅具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的功能[5],還在細(xì)胞增殖分化、凋亡等諸多方面發(fā)揮作用[6]。研究已經(jīng)報(bào)道缺氧可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡并引起細(xì)胞自噬[7]。由于mTOR通路發(fā)揮多種蛋白表達(dá)與功能的調(diào)節(jié)作用,我們設(shè)想mTOR通路可能介導(dǎo)了EGCG對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

    目前,EGCG對低氧誘導(dǎo)的凋亡與自噬方面的研究并未深入展開。EGCG是否能拮抗低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷,以及mTOR通路是否參與其中尚未明了。本研究通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mTOR的確介導(dǎo)了CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致細(xì)胞凋亡與自噬。這些方面的研究結(jié)果對于相關(guān)藥物走向臨床應(yīng)用有重要的提示作用。

    材 料 和 方 法

    1 細(xì)胞及培養(yǎng)

    PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞中心,使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期的細(xì)胞種植于6、 24、 96孔板中進(jìn)行觀察及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

    2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測細(xì)胞活力

    將對數(shù)期的細(xì)胞均勻種植于96孔板,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)及以上復(fù)孔,每孔加樣100 μL,待細(xì)胞貼壁并密度達(dá)到75%時(shí),藥物處理24 h。然后每孔加入5 μL的CCK-8試劑。2~4 h后使用450 nm酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(A)。

    3 細(xì)胞形態(tài)觀察

    將對數(shù)期的細(xì)胞均勻種植于24孔板,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)及以上復(fù)孔,每孔加樣500 μL,待細(xì)胞貼壁并密度達(dá)到75%時(shí),藥物處理24 h。然后使用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

    4 細(xì)胞免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)LC-3的表達(dá)

    細(xì)胞處理24 h后,PBS清洗細(xì)胞并用純冰甲醇固定;室溫下Ⅰ抗室溫孵育1 h;然后PBST快速洗2遍,Ⅱ抗避光室溫孵育1 h; PBST快速洗2遍后加入DAPI,室溫孵育2 min后使用熒光顯微鏡觀察,每孔取至少3個(gè)視野觀察并拍照。

    5 Western blotting檢測beclin-1和mTOR的表達(dá)

    細(xì)胞處理24 h后,提取細(xì)胞蛋白并定量。使用濃度為10%、8%的凝膠進(jìn)行蛋白電泳,電泳完畢使用PVDF膜制作“三明治”采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜;轉(zhuǎn)膜完成后常溫5%脫脂奶粉TBST封閉液封閉1 h;用TBST稀釋Ⅰ抗后搖床上孵育過夜;TBST洗膜3次,Ⅱ抗常溫下?lián)u床孵育2 h;TBST洗膜3次后成像儀顯影。

    6 ELISA檢測caspase-3的表達(dá)

    細(xì)胞處理24 h后,提取細(xì)胞中的蛋白并定量。按說明書配制好所有的試劑:酶標(biāo)板每孔加入100 μL的蛋白樣品,覆膜覆蓋后室溫在搖床上孵育3 h,3 h后去除板內(nèi)液體并在每孔加入300 μL的1×洗滌液,重復(fù)2次,然后每孔加入200 μL的1×活性液,在酶標(biāo)儀使用450 nm波長處讀取A值。

    7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    所有數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean± SEM)表示,使用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異采用單因素方差分析中的最小顯著差異檢驗(yàn)(LSD),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 CoCl2誘導(dǎo)的低氧促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡及自噬

    1.1CoCl2誘導(dǎo)的低氧促進(jìn)了PC12細(xì)胞的凋亡 不同濃度的氯化鈷(CoCl2)處理PC12細(xì)胞24 h后,顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài), CCK-8檢測細(xì)胞活力,并提取蛋白檢測細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示:50、150、250 μmol/L濃度的CoCl2處理后的PC12細(xì)胞狀態(tài)(可以從細(xì)胞形態(tài),貼壁能力及突觸的長度等來評估)明顯下降;細(xì)胞活力也隨CoCl2濃度依賴性下降,見圖1A (P<0.01);凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)明顯升高,見圖1B(P<0.05)。

    1.2CoCl2誘導(dǎo)的低氧促進(jìn)了PC12細(xì)胞自噬的發(fā)生 PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度的氯化鈷(CoCl2)處理24 h后,用Western blotting的方法檢測自噬蛋白Beclin-1的表達(dá),并采用蛋白免疫熒光的手段觀察胞核內(nèi)LC-3的表達(dá)情況。由圖1C可以觀察到beclin-1蛋白隨著CoCl2濃度的升高而表達(dá)增多,自噬標(biāo)志蛋白LC-3的表達(dá)亦存在相同的趨勢,見圖4(LC-3的表達(dá)量通過細(xì)胞核內(nèi)小藍(lán)色亮點(diǎn)的數(shù)量進(jìn)行評估),提示CoCl2誘導(dǎo)的低氧確實(shí)促進(jìn)了PC12細(xì)胞自噬的發(fā)生。

    2 EGCG拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及自噬

    2.1EGCG拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 通過細(xì)胞形態(tài)觀察我們可以發(fā)現(xiàn),與對照組相比,150 μmol/L的CoCl2誘導(dǎo)的低氧對細(xì)胞狀態(tài)有嚴(yán)重?fù)p傷,而加入不同濃度的EGCG后,細(xì)胞狀態(tài)較損傷組有明顯好轉(zhuǎn),見圖2。單用EGCG則未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)與正常PC12細(xì)胞有明顯差異,見圖4。

    同時(shí)我們使用CCK8檢測細(xì)胞活力和ELISA檢測caspase-3表達(dá)水平從而對細(xì)胞的凋亡程度進(jìn)行評估,結(jié)果顯示與150 μmol/L的CoCl2處理組相比,同時(shí)加入不同濃度的EGCG處理后,細(xì)胞活力有一定程度的恢復(fù),見圖3A(P<0.01)。相比較于CoCl2處理組,不同濃度的EGCG處理后caspase-3的表達(dá)水平有一定程度的下降,見圖3B(P<0.01)。

    Figure 1. CoCl2 induced hypoxia promoted apoptosis and autophagy in PC12 at 24 h. A: cell viability was determined by CCK-8; B: caspase-3 was determined by ELISA; C: the expression of beclin-1 was detected by Western blotting using an anti-beclin-1 antibody; D: mTOR expression was detected by Western blotting. Mean±SEM. n=3. * P<0.05, **P<0.01 vs control group (0 μmoL/L).

    2.2EGCG拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬 我們對150 μmol/L的CoCl2以及不同濃度的EGCG處理PC12細(xì)胞24 h后的自噬標(biāo)志蛋白beclin-1和LC-3進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示:CoCl2單獨(dú)處理細(xì)胞后的beclin-1表達(dá)水平明顯升高,而不同濃度EGCG的處理對beclin-1的表達(dá)水平有一定程度的抑制,見圖3C(P<0.05)。從免疫熒光我們可以觀察到與CoCl2單獨(dú)處理組相比,加入150 μmol/L的EGCG對細(xì)胞核內(nèi)LC-3的表達(dá)有一定程度的抑制,而單獨(dú)使用150 μmol/L的EGCG處理的PC12細(xì)胞LC-3的表達(dá)與對照組無明顯差異,見圖4。

    3 EGCG通過調(diào)控mTOR通路拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與自噬

    3.1CoCl2誘導(dǎo)的低氧抑制mTOR通路的表達(dá) 為明確mTOR對EGCG抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性的介導(dǎo)作用,我們用不同濃度的CoCl2處理PC12細(xì)胞24 h后,Western blotting檢測mTOR的表達(dá),從結(jié)果可以觀察到mTOR的表達(dá)水平呈濃度依賴性下降,見圖1D(P<0.05)。

    3.2EGCG拮抗CoCl2對mTOR通路的抑制作用 PC12細(xì)胞同時(shí)經(jīng)過不同濃度的EGCG處理24 h后,mTOR表達(dá)水平相較于CoCl2處理組出現(xiàn)濃度依賴性上升,見圖3D(P<0.05),單獨(dú)使用EGCG對mTOR的表達(dá)無明顯影響。提示mTOR通路可能參與介導(dǎo)了EGCG抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性。

    3.3雷帕霉素(mTOR特異性阻滯劑)逆轉(zhuǎn)了EGCG對CoCl2誘導(dǎo)的凋亡與自噬的拮抗作用 上述結(jié)果提示mTOR通路可能參與了EGCG抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性的介導(dǎo)作用,為進(jìn)一步了解EGCG是否通過mTOR通路發(fā)揮作用,我們使用mTOR特異性阻滯劑:雷帕霉素(RAPA)來阻斷mTOR通路,從細(xì)胞狀態(tài)的結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)加入RAPA處理后,EGCG對細(xì)胞狀態(tài)的改善作用被逆轉(zhuǎn);單獨(dú)使用RAPA,細(xì)胞狀態(tài)沒有發(fā)生明顯的改變,見圖2。使用RAPA后,用CCK8檢測細(xì)胞活力,我們發(fā)現(xiàn)加入RAPA處理,PC12細(xì)胞的活力較EGCG處理組明顯下降;同時(shí),凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)水平升高,見圖5(P<0.05)。

    加入RAPA處理后,EGCG對細(xì)胞自噬的抑制效果也同樣被逆轉(zhuǎn)。自噬蛋白beclin-1的表達(dá)水平較EGCG處理組有一定程度的升高,見圖5C(P<0.05)。同時(shí),RAPA處理后的EGCG組LC-3在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)水平亦出現(xiàn)升高,見圖4。而單用RAPA則對LC-3在細(xì)胞核的表達(dá)水平與對照組無明顯差異。

    Figure 2. Effect of EGCG on hypoxic apoptosis induced by CoCl2 in PC12 cells. PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG and/or RAPA for 24 h (×400). 1: control group; 2: CoCl2 50 μmol/L; 3: CoCl2 150 μmol/L; 4: CoCL2 250 μmol/L; 5:CoCl2 150 μmol/L+EGCG 10 μmol/L; 6: CoCl2 150 μmol/L+ EGCG 20 μmol/L;7: CoCl2 150 μmol/L+ EGCG 40 μmol/L; 8: EGCG 40 μmol/L; 9: CoCl2 150 μmol/L+EGCG 20 μmol/L+RAPA 100 nmol/L; 10: RAPA 100 nmol/L.

    討 論

    中國人飲茶的習(xí)慣最早始于神農(nóng)時(shí)代,時(shí)至當(dāng)今仍然被傳承與發(fā)揚(yáng)。茶葉中主要成分茶多酚的作用越來越得到研究者們的重視,表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為茶多酚生物活性的主要成分,更是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)所在。據(jù)報(bào)道:EGCG一方面有積極的抗腫瘤作用,例如肺癌[8]、宮頸癌[9]、胃癌[10]及胰腺癌[11]等,另一方面,對正常細(xì)胞的抗凋亡等保護(hù)預(yù)防作用[1]也多有研究。同時(shí),眾所周知,神經(jīng)細(xì)胞缺氧會引起一系列的生理、病理反應(yīng),像氧化應(yīng)激、自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[12]等,當(dāng)超過細(xì)胞的清除能力時(shí),會引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[13],最終導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。因此,深入闡明缺氧對神經(jīng)細(xì)胞毒性的機(jī)制對神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病防治和人類的健康同樣具有重大的意義。

    Figure 3. Effects of EGCG on hypoxic apoptosis and autophagy induced by CoCl2 in PC12 cells. PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG for 24 h. A: the cell viability was determined by CCK-8 assay; B: caspase-3 was determined by ELISA; C, D: the expression of beclin-1 and mTOR was detected by Western blotting. Mean±SEM.n=3.* P<0.05, ** P<0.01 vs control group (0 μmol/L); #P<0.05, ##P<0.01 vs CoCl2 150 μmol/L group .

    Figure 4. Effects of EGCG on hypoxic autophagy induced by CoCl2 in PC12 cells.PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG and/or RAPA for 24 h. The expression of LC-3 was determined by immunofluorescence using an anti-LC-3 antibody. 1: control group; 2: CoCl2 150 μmol/L; 3: CoCl2 150 μmol/L + EGCG 20μmol/L; 4: CoCl2 150 μmol/L + EGCG 20 μmol/L +RAPA 100 nmol/L; 5: EGCG 20 μmol/L; 6: RAPA 100 nmol/L.

    EGCG拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及自噬 PC12細(xì)胞來源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤,其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能與多巴胺能神經(jīng)元有一定相似性,廣泛地用于神經(jīng)細(xì)胞的研究。此外,一些研究表明,在許多細(xì)胞中CoCl2可以模擬誘導(dǎo)細(xì)胞的缺氧環(huán)境[14],如PC12、C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[15]。為了明確缺氧對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用,我們采用PC12細(xì)胞作為神經(jīng)細(xì)胞模型,不僅觀察了缺氧環(huán)境下神經(jīng)細(xì)胞的狀態(tài),還通過細(xì)胞活力的檢測和caspase-3的表達(dá)水平客觀評估了其凋亡程度,并檢測了細(xì)胞中自噬標(biāo)志性蛋白beclin-1和LC-3的表達(dá),事實(shí)上,CoCl2誘導(dǎo)的缺氧確實(shí)增加了細(xì)胞的凋亡,并上調(diào)了細(xì)胞的自噬作用。其它相關(guān)研究也證實(shí),CoCl2誘導(dǎo)的缺氧可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[5]、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[16]的發(fā)生。這些研究結(jié)果都與我們對缺氧環(huán)境對細(xì)胞凋亡和自噬增強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致。

    EGCG通過調(diào)控mTOR通路拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與自噬,mTOR是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶,可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成,并影響細(xì)胞的增殖、凋亡,同時(shí)在細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激、自噬等生物學(xué)功能中發(fā)揮作用[17]。我們通過檢測mTOR在CoCl2誘導(dǎo)的缺氧環(huán)境以及EGCG處理后的表達(dá)發(fā)現(xiàn):CoCl2誘導(dǎo)的缺氧抑制了mTOR的表達(dá),而EGCG則恢復(fù)了其活性,說明mTOR介導(dǎo)了CoCl2誘導(dǎo)的缺氧對神經(jīng)細(xì)胞毒性。

    Figure 5. Effects of RAPA on EGCG-induced downregulation of apoptosis in PC12 cells. PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG and/or RAPA for 24 h.A: the cell viability was determined by CCK-8 assay; B:caspase-3 was determined by ELISA;C: the expression of beclin-1 was detected by Western blotting. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs control group;# P<0.05, ## P<0.01 vs CoCl2 150 μmol/L group.

    阻斷mTOR通路后EGCG是否能拮抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性?為了得到答案,我們采用mTOR特異性阻滯劑雷帕霉素功能處理細(xì)胞后,結(jié)果提示細(xì)胞凋亡增加,凋亡蛋白caspase-3表達(dá)增多;自噬水平升高,自噬標(biāo)志蛋白beclin-1和LC-3表達(dá)均升高,說明mTOR通路阻斷后,加重了CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性,抵消了EGCG拮抗低氧所致的細(xì)胞損傷,EGCG通過調(diào)控mTOR通路發(fā)揮抑制凋亡、降低自噬的生物學(xué)作用,從而拮抗低氧所致的神經(jīng)毒性。

    值得注意的是,通過觀察阻斷mTOR通路表達(dá)的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)加入RAPA阻斷mTOR通路后相比于對照組并未完全抑制PC12細(xì)胞的活力,并且自噬水平下降的程度有限,這提示我們可能還存在其它的通路使得EGCG發(fā)揮其抗凋亡,抑制自噬的生物學(xué)作用。

    通過研究,我們證實(shí)了EGCG通過mTOR通路拮抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧引起的PC12細(xì)胞的凋亡與自噬。這為缺氧的神經(jīng)毒性機(jī)制的研究提供了新的線索和思路,基于目前的研究,運(yùn)用EGCG治療神經(jīng)細(xì)胞缺氧所致的損傷或許是新的途徑與策略,同時(shí),這對于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究與治療也開辟了新的視角。

    [參 考 文 獻(xiàn)]

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