瓦勒變性坐骨神經(jīng)段對(duì)大鼠BMSCs向SCs分化的影響*

趙富生， 武 庚， 武 楊， 金秀東， 張際緋， 李月珍△

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院， 2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

外周神經(jīng)損傷修復(fù)和神經(jīng)殘端支配區(qū)功能重建一直是臨床面對(duì)的難題。周圍神經(jīng)損傷后其遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維全長(zhǎng)及近端長(zhǎng)度不等的髓鞘和軸突發(fā)生瓦勒變性，隨后，施萬細(xì)胞(Schwanns cells, SCs) 呈現(xiàn)幼稚化而重新獲得分裂增殖能力，參與清除軸突潰變碎片，并在基底膜管內(nèi)形成Bunger帶，形成新的髓鞘。此外，SCs 還分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子(neural growth factor, NGF) 等多種活性物質(zhì)，引導(dǎo)軸突再生，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[1-2]。研究表明，分離培養(yǎng)瓦勒變性大鼠坐骨神經(jīng)的SCs并原位移植于半橫切脊髓中，SCs在損傷局部可形成細(xì)胞橋接區(qū)，引導(dǎo)軸突再生，促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)[3-4]。但自體SCs來源有限，異體SCs移植存在免疫排斥反應(yīng)，限制了SCs的臨床應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新能力。在體外不同細(xì)胞因子或特定環(huán)境誘導(dǎo)下，BMSCs可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞[5-6]。外周神經(jīng)瓦勒變性后可分泌多種生長(zhǎng)因子，其活性可持續(xù)2～3周，能否為BMSCs體外分化提供適宜的神經(jīng)微環(huán)境目前尚不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)將瓦勒變性坐骨神經(jīng)段與大鼠 BMSCs聯(lián)合培養(yǎng)，探討變性坐骨神經(jīng)段所形成的體外微環(huán)境與誘導(dǎo)BMSCs向SCs分化的關(guān)系，為臨床應(yīng)用BMSCs治療外周神經(jīng)損傷提供理論依據(jù)。

材 料 與 方 法

1 動(dòng)物和材料

SPF級(jí)1月齡SD大鼠50只，雌雄不限，體重90～120 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)為SCXK(黑)2012-010]。

胰蛋白酶、H-DMEM、FBS(Gibco)；BMSCs 培養(yǎng)液(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)；CD29、CD44和CD90 兔抗大鼠單克隆抗體(Prarmingen)；兔抗大鼠S-100多克隆抗體(上海麥莎生物有限公司)；PKH26 細(xì)胞連接試劑盒、DAPI(Sigma)；ELISA 試劑盒(Uscnlife)；FITC標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；TaKaRa One Step SYB? PrimeScript? RT-PCR Kit ( Perfect Real Time)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；Transwell(聚碳酸酯膜，孔徑 3.0 μm，Corning)。

2 方法

2.1BMSCs 的培養(yǎng)及鑒定 取體重為(100±5)g的SD大鼠乙醚吸入麻醉后脫頸處死，置75%乙醇中浸泡約5 min，無菌條件下分離出股骨和脛骨，在無血清DMEM培養(yǎng)液中，除凈長(zhǎng)骨表面軟組織。乙醇浸泡l min后，用無血清DMEM培養(yǎng)液洗去乙醇。剪除兩端骨密質(zhì)暴露骨髓腔，用10 mL BMSCs 培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，200 目無菌篩網(wǎng)過濾，以1×109/L細(xì)胞密度接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，在5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，3 d后更換新鮮培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞。以后每隔3 d換液，并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。待原代培養(yǎng)細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底面積的80%時(shí)，用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化貼壁細(xì)胞，按l∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，記作第1代(P1)，選取生長(zhǎng)均一的第3代(P3)BMSCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取P3 BMSCs行免疫熒光染色檢測(cè) CD29、CD44和CD90 表達(dá)。

2.2瓦勒變性坐骨神經(jīng)段制備及實(shí)驗(yàn)分組 取40只SD大鼠，戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，無菌條件下暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，于坐骨切跡遠(yuǎn)側(cè)5 mm處切斷坐骨神經(jīng)，以5/0 尼龍線結(jié)扎兩斷端，并將近端神經(jīng)斷端埋植于股二頭肌中，防止兩斷端粘連，然后逐層縫合肌肉，淺筋膜和皮膚，肌注青霉素1×104U，連續(xù)3 d。術(shù)后第7天，重新暴露大鼠術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)和對(duì)側(cè)正常坐骨神經(jīng)，分別切取10 mm近端變性坐骨神經(jīng)和10 mm對(duì)側(cè)正常坐骨神經(jīng)，體式顯微鏡下剝離神經(jīng)外膜，剪成1 mm小段，在Transwell雙層培養(yǎng)體系內(nèi)與BMSCs 進(jìn)行雙層聯(lián)合培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為3組：將瓦勒變性坐骨神經(jīng)段與BMSCs在Transwell 內(nèi)進(jìn)行雙層聯(lián)合培養(yǎng)(A組)——收集P3 BMSCs進(jìn)行PKH26 標(biāo)記，用10%FBS-BMSCs培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1×107cells/L，取2 mL加入下室，補(bǔ)10%FBS-BMSCs培養(yǎng)液至2.5 mL,將瓦勒變性坐骨神經(jīng)段置Transwell上層，加1 mL 10% FBS-BMSCs培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng); 將正常坐骨神經(jīng)段與BMSCs在Transwell 內(nèi)聯(lián)合培養(yǎng)，方法同上(B組)；BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為10% FBS-BMSCs培養(yǎng)液(C組)。

2.3BMSCs 總RNA提取 聯(lián)合培養(yǎng)第0、1、4、7、11、14天，取各組BMSCs，加Trizol液1 mL/well，吹打后收集到無RNA酶的EP管中，振蕩室溫放置5 min；加0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；吸取上清，置于新的無RNA酶的EP 管，加等體積異丙醇，渦旋混勻，室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離10 min；留沉淀，加1 mL 75% 乙醇，顛倒數(shù)次，4 ℃、7 500 r/min 離心5 min；去上清，快速離心后吸干乙醇，室溫下敞蓋放置3 min，加20 μL DEPC水溶解，檢測(cè)RNA的 濃度、純度和質(zhì)量。

2.4BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡下觀察聯(lián)合培養(yǎng)后各組 BMSCs 形態(tài)變化。聯(lián)合培養(yǎng)第7天，用免疫熒光染色鑒定BMSCs分化。取各組BMSCs，PBS 洗滌3次，每次5 min；4% 多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌3次，每次5 min；加1% Triton X-100，37 ℃孵育10 min，PBS洗滌3次，每次5 min；山羊血清封閉60 min；加兔抗大鼠S-100(1∶200)多克隆抗體 4 ℃過夜，PBS 洗滌3次，每次5 min；加 FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3次，每次5 min；DAPI(5 mg/L)核染色，熒光顯微鏡觀察BMSCs分化情況。隨機(jī)取10個(gè)非重疊視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性表達(dá)率。

2.5BMSCs生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 聯(lián)合培養(yǎng)第0、1、4、7、11、14天，取各組BMSCs，去除培養(yǎng)液，PBS 洗滌3次，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制BMSCs生長(zhǎng)曲線。

2.6ELISA 法檢測(cè)NGF的含量 聯(lián)合培養(yǎng)第0、1、4、7、11、14天，分別收集各組6個(gè)培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液1 mL 裝于EP 管中，1 000 r/min 離心5 min，取上清液裝于另一EP 管中，置-20 ℃冰箱保存。按照 ELISA試劑盒操作步驟，檢測(cè)培養(yǎng)液上清中NGF含量。

2.7S-100 mRNA表達(dá)的檢測(cè) 按照One Step SYBR PrimeScript? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)試劑盒說明程序檢測(cè)聯(lián)合培養(yǎng)第0、1、4、7、11、14 d各組BMSCs S-100 mRNA表達(dá)。Real-time RT-PCR反應(yīng)體系為50 μL：包括2×One Step SYBR? RT-PCR Buffer Ⅲ 25 μL，TaKaRa ExTaq? HS 1 μL，PrimeScript? RT Enzyme Mix Ⅱ 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ROX Reference DyeⅡ 1 μL，RNA 4 μL，ddH2O 16 μL，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，于7500 Fast Real-Time PCR 儀上進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢后進(jìn)行熔解曲線分析?；虮磉_(dá)變化倍數(shù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行比較，管家基因β-actin作為內(nèi)參照。引物設(shè)計(jì)和合成利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列如下：S-100上游引物為5’-GTCCACACCCAGTCCTCTCTGGAG-3’，下游引物為5’-CCGGAGGCTCCTGGTCACCTTTTG-3’；β-actin上游引物為5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物為5’-TGTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3’。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較運(yùn)用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BMSCs培養(yǎng)及鑒定

BMSCs原代培養(yǎng)第3天，細(xì)胞呈不規(guī)則形或多角形，貼壁生長(zhǎng)；培養(yǎng)第7天，BMSCs 數(shù)量顯著增多，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形均勻分布。傳代后BMSCs 生長(zhǎng)更加迅速，細(xì)胞體積較原代大，形態(tài)趨于一致，呈束狀或漩渦狀排列。免疫熒光鑒定BMSCs呈CD44、CD29和CD90 表達(dá)陽性，見圖1。

Figure 1. Identification of rat BMSCs by immunofluorescence staining (×200).

2 BMSCs與坐骨神經(jīng)段聯(lián)合培養(yǎng)的相關(guān)檢測(cè)

2.1BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 聯(lián)合培養(yǎng)第1天，各組BMSCs大部分貼壁，呈梭形或多角形。聯(lián)合培養(yǎng)第3 d，A組部分BMSCs形態(tài)開始變化，原寬大的BMSCs變小變圓。聯(lián)合培養(yǎng)第7天，A 組大部分BMSCs 胞體回縮，呈圓形或錐形，兩端伸出突起，形態(tài)類似SCs細(xì)胞。B、C組僅有小部分BMSCs形態(tài)發(fā)生類似改變，這表明瓦勒變性坐骨神經(jīng)段可有效促進(jìn)BMSCs向SCs樣細(xì)胞分化，見圖2。

Figure 2. Morphological observation of BMSCs in each group at 7 d after co-culture (×100).A: group A;B: group B;C: group C.

2.2BMSCs的分化鑒定 聯(lián)合培養(yǎng)第7天，熒光顯微鏡下可見，A 組大部分BMSCs呈綠色熒光，細(xì)胞呈雙極形、多極形或錐形，形態(tài)類似SCs細(xì)胞；PKH26 標(biāo)記的BMSCs均呈紅色熒光，S-100 表達(dá)陽性的BMSCs 呈紅色、綠色疊加的桔色熒光。B組少部分BMSCs 呈紅色、綠色疊加的桔色熒光，C組極少數(shù)BMSCs 呈紅色、綠色疊加的桔色熒光，見圖3。A 組BMSCs 的S-100陽性表達(dá)率為31.1%±2.9%，B組和C組BMSCs 的S-100陽性表達(dá)率分別為16.2%±1.7% 和0.42%±0.07%，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果表明，來源于瓦勒變性坐骨神經(jīng)的神經(jīng)段能有效誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)SCs標(biāo)記蛋白S-100。

Figure 3. Differentiation of BMSCs detected by immunofluorescence staining at 7 d after co-culture (×100). A: group A; B: group B; C: group C.

2.3BMSCs的生長(zhǎng)曲線 各組BMSCs生長(zhǎng)曲線均近似“S”形，見圖4。聯(lián)合培養(yǎng)第0、1、2、3天各組BMSCs生長(zhǎng)緩慢，第6～9天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第11天達(dá)到最高峰，此后各組細(xì)胞增殖變緩，進(jìn)入平臺(tái)期。A組BMSCs增殖速度明顯快于B、C組，B組BMSCs增殖速度快于C組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，由此可見瓦勒變性坐骨神經(jīng)段明顯促進(jìn)BMSCs增殖。

2.4NGF含量的檢測(cè) ELISA 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A組培養(yǎng)液上清中NGF含量于聯(lián)合培養(yǎng)后逐漸增多，呈時(shí)間依賴性，于聯(lián)合培養(yǎng)第7天達(dá)高峰，隨后呈下降趨勢(shì)。B、C 組NGF含量隨時(shí)間延長(zhǎng)有所增加，但顯著低于A組。聯(lián)合培養(yǎng)第4、7、11、14天，A 組NGF含量明顯高于B、C 組，同時(shí)，B組高于C組，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

Figure 4. Growth curve of BMSCs in each group at different time points after co-culture. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs group C; #P<0.05 vs group B.

表1 聯(lián)合培養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)各組養(yǎng)液上清的NGF含量

2.5S-100 mRNA表達(dá)的檢測(cè) 聯(lián)合培養(yǎng)第0、1天，各組BMSCs中S-100 mRNA表達(dá)無明顯差異；聯(lián)合培養(yǎng)第4、7、11、14天，A組 BMSCs 中S-100 mRNA表達(dá)顯著高于B、C組，B組亦高于C組，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。這表明瓦勒變性坐骨神經(jīng)段在較短的時(shí)間內(nèi)即可刺激BMSCs中S-100 mRNA表達(dá)增加。

Figure 5. S-100 mRNA expression of BMSCs at different time points after co-culture. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs group C; #P<0.05 vs group B.

討 論

1850年，Waller[7]最早報(bào)道了周圍神經(jīng)損傷后，損傷遠(yuǎn)端的神經(jīng)纖維全長(zhǎng)及近端長(zhǎng)度不等的髓鞘和軸突崩解破壞，即瓦勒變性。瓦勒變性過程中，SCs 呈現(xiàn)幼稚化而重新獲得分裂增殖能力，參與清除軸突潰變碎片，并在基底膜管內(nèi)形成Bunger帶，形成新的髓鞘；同時(shí)SCs 還分泌多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子和表面黏附分子引導(dǎo)再生軸突延伸，促進(jìn)軸突再髓鞘化過程。因此，SCs在神經(jīng)纖維損傷修復(fù)過程中，發(fā)揮著極為重要的作用[8-10]。但SCs屬于外周神經(jīng)終末細(xì)胞，體外培養(yǎng)增殖速度緩慢，臨床中難以獲取足量SCs[11]。此外，SCs具有抗原性，異種移植會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，因而極大地限制了SCs的臨床應(yīng)用。為此，本研究設(shè)計(jì)了瓦勒變性大鼠坐骨神經(jīng)段與BMSCs共培養(yǎng)體系，探討變性坐骨神經(jīng)段形成的體外神經(jīng)微環(huán)境能否誘導(dǎo)BMSCs 向SCs分化，并觀察在分化過程中BMSCs形態(tài)、分泌功能的變化，旨在為臨床應(yīng)用BMSCs治療外周神經(jīng)損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

BMSCs為一種成體干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新及多向分化潛能。研究發(fā)現(xiàn)[12-13]，BMSCs 在體外不同細(xì)胞因子或特定誘導(dǎo)環(huán)境作用下可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞。此外，BMSCs 來源豐富、易于獲取、可自體移植，有效避免了排斥反應(yīng)及倫理爭(zhēng)議[14-15]，因此近年來BMSCs成為組織工程理想的種子細(xì)胞。Babe等[16]研究發(fā)現(xiàn)，利用化學(xué)復(fù)合物(丁羥基茴香醚、氫化可的松、福斯高林、胰島素、KCl、維甲酸)和細(xì)胞因子(EGF、HGF、VEGF)作為刺激因素均可在體外誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，但分化比例有所不同。夏長(zhǎng)所等[17]建立了以富含血小板血漿為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)BMSCs分化為SCs的培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)9～11 d 后，發(fā)現(xiàn)BMSCs分化為SCs樣細(xì)胞。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，SCs 與BMSCs培養(yǎng)體系中BMSCs在SCs形成的體外微環(huán)境誘導(dǎo)作用下可分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞[18]。但該培養(yǎng)體系由于從坐骨神經(jīng)分離、培養(yǎng)SCs時(shí)程較長(zhǎng)，需大約3～4周才能獲取高純度SCs，從而導(dǎo)致臨床中錯(cuò)過了應(yīng)用BMSCs治療外周神經(jīng)損傷的最佳時(shí)機(jī)。因此，本研究采用瓦勒變性坐骨神經(jīng)段與BMSCs聯(lián)合培養(yǎng)，有效地縮短了獲取種子細(xì)胞的周期，為臨床外周神經(jīng)損傷的治療贏得了寶貴時(shí)間。該體系將變性坐骨神經(jīng)段與PKH26標(biāo)記的BMSCs聯(lián)合培養(yǎng)于同一雙層小室中，坐骨神經(jīng)段位于小室上層，下層接種BMSCs，中間有微孔網(wǎng)膜相隔，神經(jīng)段分泌的生物活性物質(zhì)可以通過網(wǎng)孔作用于BMSCs。Torres等[19]研究發(fā)現(xiàn)，取成年大鼠坐骨神經(jīng)切成長(zhǎng)約2 mm的神經(jīng)段，在199完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)1、4、7、14 d后制備坐骨神經(jīng)條件培養(yǎng)液。用該培養(yǎng)液作用體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞72 h，可有效促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞的存活、增殖和分化，并增加視網(wǎng)膜細(xì)胞的黏附能力。本研究室前期研究結(jié)果也表明[3-4]，切斷大鼠坐骨神經(jīng)使其在體內(nèi)預(yù)變性，然后通過改變培養(yǎng)液血清濃度和神經(jīng)段移植的方法，約3周即可從變性坐骨神經(jīng)段分離培養(yǎng)出高純度SCs。這些研究表明，瓦勒變性坐骨神經(jīng)段在體外培養(yǎng)2～3周仍具有活性，可影響B(tài)MSCs的分化。PKH26 是一種帶有長(zhǎng)脂肪族末端的紅色熒光染料，可與BMSCs膜上的脂類區(qū)域穩(wěn)定結(jié)合，不會(huì)從已標(biāo)記細(xì)胞向未標(biāo)記細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并且隨著細(xì)胞分裂，標(biāo)記物也幾乎等份地分配給2個(gè)子細(xì)胞[20]。因此，可通過標(biāo)記的紅色熒光來確定分化細(xì)胞的來源和計(jì)算細(xì)胞分化率。

為確定BMSCs 在瓦勒變性坐骨神經(jīng)段的誘導(dǎo)作用下能否分化為SCs，以及BMSCs在分化過程中表達(dá)SCs標(biāo)志物S-100 的情況，本研究通過免疫組化和real-time PCR檢測(cè)BMSCs在分化過程中S-100蛋白及mRNA的變化情況。S-100是一種由多基因編碼的分子量為9～13 kD的鈣離子結(jié)合蛋白，由S-100A和S-100B亞基組成3種形式：S-100AA、S-100BB和S-100AB，以同源或異源二聚體的形式發(fā)揮作用。其中S-100BB以高濃度特異地存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的SCs以及它們的腫瘤中，常被用作SCs的標(biāo)志物[21-23]。S-100蛋白參與各種鈣離子依賴性的細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)過程，例如蛋白磷酸化、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞分化等過程[24]。在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，S-100蛋白主要分布在成熟SCs的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞膜上，對(duì)軸突再生具有刺激和誘導(dǎo)作用[25]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合培養(yǎng)過程中BMSCs形態(tài)發(fā)生明顯變化，聯(lián)合培養(yǎng)第7天，A 組可見大部BMSCs分胞體回縮，兩端伸出突起，形態(tài)類似SCs，而B組僅有小部分BMSCs 形態(tài)發(fā)生類似改變，C 組BMSCs 形態(tài)幾乎沒有發(fā)生變化。在聯(lián)合培養(yǎng)第7天，采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)對(duì)BMSCs 進(jìn)行S-100鑒定。結(jié)果顯示，A 組BMSCs向SCs分化率明顯高于B組和C 組。為進(jìn)一步明確聯(lián)合培養(yǎng)后不同時(shí)點(diǎn)BMSCs分化情況，研究中檢測(cè)了各組BMSCs中S-100 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果示，A組BMSCs中S-100 mRNA表達(dá)水平顯著高于B組和C組，與免疫熒光鑒定結(jié)果相一致，提示瓦勒變性坐骨神經(jīng)段形成的體外微環(huán)境可持續(xù)有效地促進(jìn)BMSCs向SCs分化。為探討瓦勒變性坐骨神經(jīng)段對(duì)BMSCs分泌功能的影響，我們選擇了NGF作為研究對(duì)象，在聯(lián)合培養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NGF進(jìn)行檢測(cè)。NGF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，對(duì)胚胎發(fā)育以及對(duì)神經(jīng)嵴起源的神經(jīng)元功能的維持具有重要作用[26-27]。作為神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性物質(zhì)之一，NGF具有促進(jìn)神經(jīng)元分化和遷移、修復(fù)受損神經(jīng)組織細(xì)胞、保護(hù)軸突和髓鞘炎性損壞的作用[28-30]。有文獻(xiàn)報(bào)道，NGF mRNA在神經(jīng)受損后迅速增高，可持續(xù)高表達(dá)l～2周[31]。外周神經(jīng)損傷后NGF主要來源于局部增殖的SCs[32]。Yuan等[33]和Yaghoobi等[34]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs在誘導(dǎo)分化后可表達(dá)一定量的NGF，并參與了BMSCs分化及其表型的維持過程，但NGF分泌量隨BMSCs傳代次數(shù)增加有所降低。本研究室前期研究結(jié)果表明，大鼠坐骨神經(jīng)在未受到損傷情況下，神經(jīng)段培養(yǎng)液上清中NGF含量很低，提示SCs合成NGF蛋白量很少。然而，在瓦勒變性坐骨神經(jīng)段培養(yǎng)液中NGF含量明顯升高，為正常坐骨神經(jīng)段的2.0倍，且可持續(xù)2～3周。因此，本研究通過檢測(cè)NGF含量，間接觀察瓦勒變性坐骨神經(jīng)段在BMSCs向SCs分化中的作用。ELISA 檢測(cè)結(jié)果示，A組培養(yǎng)液上清中NGF含量在聯(lián)合培養(yǎng)后第4天明顯高于B、C組。可能由于BMSCs在分化過程中，源于BMSCs的SCs分泌大量NGF，同時(shí)也以反饋方式促進(jìn)BMSCs分裂與增殖，分泌更多NGF，從而導(dǎo)致NGF含量增加。

綜上所述，瓦勒變性坐骨神經(jīng)段形成的體外微環(huán)境可有效促進(jìn)BMSCs向SCs樣細(xì)胞分化，在分化過程中變性坐骨神經(jīng)段分泌的多種生物活性物質(zhì)可能參與調(diào)控BMSCs的分化。有研究表明，外周神經(jīng)瓦勒變性過程中可合成、分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，包括NGF、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和軸突生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子等[31，35]。這些因子的受體存在BMSCs 細(xì)胞膜上，與其結(jié)合后將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，對(duì)BMSCs分化起調(diào)節(jié)作用[36]。此外，變性坐骨神經(jīng)段還可產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞外黏附因子[37]。這些蛋白分子也可能介導(dǎo)變性神經(jīng)段與BMSCs間的相互作用，誘導(dǎo)BMSCs 向SCs分化。但源于BMSCs的SCs樣細(xì)胞是否具有正常的生理功能尚待進(jìn)一步深入研究。

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