淫羊藿苷對(duì)受損斑馬魚胚胎血管發(fā)生的促進(jìn)作用

李 菲, 黃曉慧, 龔其海, 李銘源, 董紅心,3, 石京山

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.澳門大學(xué) 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院， 澳門 000853；3.美國(guó)西北大學(xué) 精神病學(xué)與行為科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，美國(guó) 芝加哥 60611)

淫羊藿又名仙靈脾，為小檗科(Berberidaceae)淫羊?qū)?EpimediumL)植物。據(jù)《中國(guó)藥典》記錄，淫羊藿具有很高的藥用價(jià)值，性味辛、甘、溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功效[1]。淫羊藿主要有效成分之一，淫羊藿苷(icariin, ICA)屬于黃酮類化合物，藥理作用廣泛包括抗腫瘤，促進(jìn)骨形成，以及保護(hù)神經(jīng)元等[2]。ICA在血管系統(tǒng)的突出作用一直備受關(guān)注，表現(xiàn)為抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善血液流變學(xué)等[3]。近來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道，ICA在體外可促進(jìn)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖[4]。然而ICA在整體環(huán)境下是否可促血管生成尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚血管受損模型，研究ICA對(duì)血管發(fā)生的影響。

1 材料

熒光顯微鏡(Leica熒光顯微鏡，德國(guó)Leica公司)；淫羊藿苷(南京澤朗醫(yī)藥技術(shù)有限公司，經(jīng)HPLC測(cè)定其純度≥96%)；血管生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VEGFR Kinase Inhibitor‖, VRI, Clabiochem company/EMD chemicals Inc, cat. no.676481)；所用斑馬魚為Tg(fli-1:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚由澳門大學(xué)提供。

2 方法

2.1 斑馬魚的飼養(yǎng) 斑馬魚的飼養(yǎng)方法根據(jù)斑馬魚手冊(cè)的描述而設(shè)定。在25 L的反滲水中飼養(yǎng)，水溫控制在攝氏28℃，光照按14 h日光和10 h無(wú)光為周期，每天早上9:30開(kāi)始光照，每日以豐年蝦及熱帶魚糧于早上及下午喂飼2次。

2.2 斑馬魚胚胎的收集 光照后1 h收集胚胎，繼續(xù)培養(yǎng)在反滲水中，溫度28.5℃。于受精后4h保留健康胚胎，挑出未受精及發(fā)育不健全的胚胎。

2.3 模型制備及藥物處理 健康斑馬魚胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至21 h后拆蛋殼，分為6組(每組10～15條，重復(fù)2次)，空白對(duì)照組(Control)、模型對(duì)照組(VRI)、不同濃度ICA處理組(30，100，300 μM)。除空白對(duì)照組外，其余4組均給予工具藥血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑(VRI)500 ng·mL-1作用3 h，清洗掉含VRI的培養(yǎng)液[5]，更換為不同濃度的ICA培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 、48 h，用藥結(jié)束后采用熒光顯微鏡觀察。

3 結(jié)果

淫羊藿苷對(duì)VRI作用3 h所致斑馬魚胚胎體節(jié)間血管和腸下靜脈受損的影響。VRI作用于斑馬魚胚胎3 h后，將培養(yǎng)液清洗并替換為含有不同濃度ICA的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 、48 h。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖1)：空白對(duì)照組胚胎于24 、48 h均可見(jiàn)完整的體節(jié)間血管，數(shù)量為28±1.9條，幾乎無(wú)受損血管，血管綠色熒光清晰明亮。給予VRI作用3 h后的模型對(duì)照組胚胎內(nèi)完整的體節(jié)間血管幾乎全部缺失，24 h觀察到殘存的受損血管數(shù)量3.3±2.2條，而48 h后開(kāi)始恢復(fù)，受損血管數(shù)量達(dá)9.3±2.2條。給予ICA后能明顯增加完整的體節(jié)間血管數(shù)量，并隨著藥物劑量增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)完整的血管數(shù)量也增多。30 μM的ICA作用24 、48 h斑馬魚所有血管數(shù)量為7.4±2.4和10.9±4.0條；ICA在100 μM時(shí)作用24 、48 h后血管數(shù)量為17±2.7和22.3±5.2條；300 μM作用24、48 h后血管數(shù)量分別為23.2±3.1和25.6±2.7條。100和300 μM的ICA給藥組斑馬魚體節(jié)間血管數(shù)量均比模型對(duì)照組多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

n=10～15，重復(fù)2次。vs Control, *P<0.05；vs VRI, #P<0.05。VRI：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑；ICA：淫羊藿苷；ISVs：體節(jié)間血管；SIVs：腸下靜脈；hrs：小時(shí)數(shù)；柱狀圖紅色部分：完整的ISVs；藍(lán)色部分：不完整的ISVs；縱坐標(biāo)為血管條數(shù)。 圖1 淫羊藿苷對(duì)VRI作用3 h所致斑馬魚胚胎體節(jié)間血管和腸下靜脈受損的影響

ICA對(duì)斑馬魚胚胎腸下靜脈的發(fā)生也具有促進(jìn)作用的趨勢(shì)，但不如對(duì)體節(jié)間血管的作用明顯，本實(shí)驗(yàn)未對(duì)該作用進(jìn)行量化分析。

4 討論

淫羊藿苷結(jié)構(gòu)清楚屬8-異戊烯黃酮醇苷化合物，分子式C33H40O15，分子量676.67，我室研究發(fā)現(xiàn)ICA在體內(nèi)代謝可誘導(dǎo)藥物代謝Ⅱ相酶的表達(dá)[6]。大量體外實(shí)驗(yàn)表明，ICA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有積極的促進(jìn)作用，如提高eNOS活性增加NO的產(chǎn)生而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[7]；刺激體外血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管形成[8]；促雞胚尿囊膜模型和牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞模型的血管生成[9]；激活內(nèi)皮祖細(xì)胞MEK/ERK和PI3K/Akt/eNOS信號(hào)途徑刺激血管生成[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ICA可促進(jìn)整體模型轉(zhuǎn)基因斑馬魚的血管發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)采用的Tg(fli-1:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚是一種能在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的組織特異性轉(zhuǎn)基因斑馬魚[11]，是理想的觀察胚胎血管系統(tǒng)發(fā)育的可視性模型。Tg(fli-1:EGFP)系轉(zhuǎn)基因斑馬魚能表達(dá)位于fli-1啟動(dòng)子上的EGFP序列[12]，而fli-1是一個(gè)在小鼠身上廣泛使用的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記基因[13]，同時(shí)也在斑馬魚胚胎血管發(fā)育時(shí)會(huì)表達(dá)[14]。與活胚胎的微血管攝影技術(shù)相比較，轉(zhuǎn)基因斑馬魚能在不同的時(shí)間點(diǎn)，不需要對(duì)斑馬魚血管進(jìn)行任何固定的處理，就能實(shí)時(shí)地進(jìn)行血管系統(tǒng)發(fā)育的觀察。因此，在研究有關(guān)血管新生的藥物效應(yīng)上，Tg(fli-1:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚是一個(gè)非常有價(jià)值的整體模型。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是血管形成過(guò)程中最具特異性的生長(zhǎng)因子[15]，其作用的發(fā)揮在于與其受體(VEGF-R)結(jié)合后引發(fā)的一系列信號(hào)途徑相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑(VRI)與轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎共孵育3 h導(dǎo)致斑馬魚胚胎體節(jié)間血管和腸下靜脈幾乎全部缺失，進(jìn)一步證實(shí)了VEGF-R在血管發(fā)生過(guò)程中的重要作用。采用不同濃度的ICA治療后，受損的血管逐漸恢復(fù)，完整血管的數(shù)量隨藥物劑量的增加和藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。而對(duì)于ICA促血管發(fā)生的作用機(jī)制是在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體層面，還是受體前，或受體后的信號(hào)調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)未及探討，故對(duì)其機(jī)制研究仍需繼續(xù)深入。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ICA在整體情況下具有顯著促血管發(fā)生的作用，以此研究為基礎(chǔ)，有望研制開(kāi)發(fā)一些具有臨床應(yīng)用價(jià)值的藥物，為防治血管缺血性疾病提供一種新的策略。

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