小柴胡湯對(duì)肝纖維化大鼠肝臟CYP2E1表達(dá)的影響

李 晉，徐尚福，張曉潔，白國(guó)輝，羅 果

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨藥理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間病理階段，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)的激活是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]?，F(xiàn)認(rèn)為在組織、細(xì)胞、分子水平上的主要促纖維化發(fā)生機(jī)制包括創(chuàng)傷愈合反應(yīng)的慢性活化、氧化應(yīng)激、上皮-間質(zhì)相互作用的紊亂[2]。氧化應(yīng)激本身即可活化HSC，促進(jìn)肝纖維化形成。CYP2E1是肝臟藥物代謝酶系細(xì)胞色素P450的重要亞型，與氧化應(yīng)激(Oxidative Sress, OS)關(guān)系密切[3]。因此本研究通過(guò)觀察小柴胡湯對(duì)肝纖維化大鼠肝組織CYP2E1表達(dá)的影響，探討小柴胡湯抗肝纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 小柴胡顆粒(四川禾潤(rùn)制藥有限公司，批號(hào)：110505)；四氯化碳-分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)；RNAiso plus、Power SYBR Green PCR Master Mix、Prime ScriptTMRT reagent Kit及Primer均購(gòu)自TakaRa公司；兔抗大鼠CYP2E1多克隆抗體(bs-1725R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；免疫組化檢測(cè)試劑盒(GK500705，基因科技上海有限公司)。

1.2 分組與給藥 健康SD雄性大鼠(SPF級(jí)，合格證號(hào)：SCXK(渝)2007-0005)，體重200±20g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組(每組10只)，包括空白對(duì)照組(control)，模型組(model)，小柴胡湯低(XCHT(1g/kg))、中(XCHT(2g/kg))、高(XCHT(4g/kg))劑量組(小柴胡顆粒1 g=3.58g原生藥)[4]。皮下注射10%四氯化碳5 mL/kg造模，每周2次，共14周[5]，空白對(duì)照組以同樣方法皮下注射等量生理鹽水。第9周開(kāi)始治療組按1 mL/100g灌胃給藥6周，每天1次(空白對(duì)照組和模型組給予等量蒸餾水)。第14周末將全部大鼠隔夜禁食，次日以乙醚麻醉腹主動(dòng)脈采血處死，迅速切取2塊肝組織，一塊用10%的甲醛固定后制備石蠟切片，另一塊于-80°冰箱保存用于Real-time RT-PCR。

1.3 肝組織病理學(xué)檢查 新鮮同部位肝組織10%福爾馬林固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明后石蠟包埋。切片后二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察肝組織纖維化程度和炎癥浸潤(rùn)程度。

1.4 肝組織免疫組化方法檢測(cè)CYP2E1蛋白表達(dá) 按說(shuō)明書(shū)采用2步法進(jìn)行免疫組化染色。標(biāo)本用中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟，3%H2O2溶液去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.1mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行高壓熱修復(fù)3min，正常山羊血清封閉非特異性抗原，滴加兔抗大鼠CYP2E1抗體(1∶200稀釋)，4℃孵育過(guò)夜后加二抗，DAB顯色。采用image proplus 6.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行積分光密度(IOD)值分析。

1.5 Real-time RT-PCR檢測(cè)大鼠肝臟組織CYP2E1 mRNA表達(dá) 采用Trizol抽提總RNA，純化后紫外分光光度計(jì)進(jìn)行樣品純度和濃度鑒定。從NCBI中查出相關(guān)基因序列，由TaKaRa生物工程公司設(shè)計(jì)合成(見(jiàn)表1)。2步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為20μL ，95℃×3min預(yù)變性；95℃×10s變性；60℃×1min退火，40循環(huán)。結(jié)果采用相對(duì)定量法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[6]。

表1引物序列

2 結(jié)果

2.1 肝臟病理學(xué)改變 HE染色顯示，給予CCl4造模后大鼠肝組織正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，多數(shù)肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)有膠原纖維條索形成；小柴胡湯給藥后肝組織破壞現(xiàn)象明顯改善，中央靜脈周圍呈放射狀排列的肝細(xì)胞索破壞有明顯改善，肝小葉破壞狀況明顯好轉(zhuǎn)，脂肪變性減輕，其中以高劑量組效果最為顯著(見(jiàn)圖1)。

2.2 小柴胡湯對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組織CYP2E1蛋白表達(dá)的影響 肝組織胞膜及胞漿內(nèi)棕黃色顆粒為CYP2E1陽(yáng)性表達(dá)?？瞻讓?duì)照組大鼠肝組織中央靜脈周圍見(jiàn)少量CYP2E1(0.78×105±0.17×105)沉積；模型組CYP2E1(2.69×105±1.06×105)呈彌漫性分布，與空白對(duì)照組相比，表達(dá)明顯增多(P<0.01)。與模型組比較，小柴胡湯中(1.47×105±0.45×105,P<0.05)、高劑量組CYP2E1(1.03×105±0.29×105,P<0.01)表達(dá)明顯減少，小柴胡湯低劑量組(2.65×105±0.76×105)與模型組相比無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖2、3)。

A：control；B：model；C：XCHT(4g/kg)。圖1 小柴胡湯對(duì)肝纖維化大鼠肝組織形態(tài)學(xué)影響(×100)

A：control；B：model；C：XCHT(1g/kg)；D：XCHT(2g/kg)；E：XCHT(4g/kg)；標(biāo)尺為20μm。圖2 小柴胡湯對(duì)肝纖維化大鼠肝組織CYP2E1蛋白表達(dá)的影響(×200)

圖3 各組大鼠肝組織CYP2E1蛋白積分光密度(IOD)值比較

2.3 小柴胡湯對(duì)肝纖維化大鼠肝組織CYP2E1 mRNA的表達(dá)的影響 Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，模型組肝組織CYP2E1 mRNA(205.4±39.497)表達(dá)較空白對(duì)照組(100.00±22.73)明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，小柴胡湯各劑量組均下調(diào)CYP2E1 mRNA的表達(dá)，小柴胡湯高劑量組CYP2E1 mRNA(106.92±27.32)的表達(dá)顯著下降(P<0.01)，小柴胡湯低、中劑量組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖4)。

圖4 小柴胡湯對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組織CYP2E1 mRNA的表達(dá)的影響

3 討論

肝纖維化是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必然途徑，積極防治肝纖維化理應(yīng)引起人們的高度重視。小柴胡湯出自《傷寒論》，是中醫(yī)十大名方之一，為治少陽(yáng)病之主方。由柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、生姜、大棗7味藥組成。現(xiàn)代研究表明，小柴胡湯具有顯著的抗炎保肝、解熱鎮(zhèn)痛等作用，在臨床上主要用于治療慢性乙型肝炎、肝纖維化、預(yù)防肝癌，是日本漢方藥中產(chǎn)量最大和用量最多的方劑[7]。本研究顯示小柴胡湯可改善CCl4引起的大鼠肝纖維化的病理學(xué)狀態(tài)。

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)是位于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一組混合功能氧化酶系，是肝臟代謝最主要的酶系之一，人類中確定的CYP450同工酶有20多種，CYP2E1是最主要的同工酶，在肝臟中占肝細(xì)胞色素酶總量的7%，參與許多低分子有機(jī)化合物及藥物在體內(nèi)的代謝，并能催化許多前致癌物和前毒物的活化過(guò)程。CYP2E1可以引起許多毒物物質(zhì)的代謝盒激活，催化產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，如超氧陰離子基團(tuán)和過(guò)氧化氫等，與氧化應(yīng)激關(guān)系密切[8]。氧化應(yīng)激，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，產(chǎn)生過(guò)多活性氧( reactive oxygen species，ROS)。過(guò)多的ROS攻擊細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子，是引起眾多疾病發(fā)生的重要原因。目前有研究證實(shí)多種急、慢性肝病及肝硬化中存在氧化應(yīng)激，從而加重疾病的病理進(jìn)程[9]。過(guò)多的ROS增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，損傷細(xì)胞生物膜功能，并通過(guò)協(xié)同細(xì)胞因子及肝細(xì)胞凋亡使肝細(xì)胞炎癥、壞死及纖維化加重[10]。肝細(xì)胞內(nèi)CYP2E1表達(dá)增加是ROS產(chǎn)生的主要原因。本課題研究表明CCl4引起的大鼠肝纖維化組織CYP2E1表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，說(shuō)明CYP2E1參與肝纖維化的形成。而小柴胡湯可下調(diào)CYP2E1的表達(dá)，提示小柴胡湯可能通過(guò)抑制CYP2E1的表達(dá)而改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。

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