馬鈴薯塊莖特異性啟動子克隆及其驅動的hIL12表達載體構建

楊加偉，李 偉，葛正龍

(遵義醫(yī)學院 生物化學教研室，貴州 遵義 563099)

植物生物反應器具有操作簡便、產物活性高、成本低、易擴大規(guī)模等優(yōu)點，與微生物及動物細胞等其它生物反應器相比有獨特的優(yōu)勢，因此在細胞因子、生長因子、抗體及疫苗等藥用蛋白制造領域獲得了廣泛的研究和應用[1]。白細胞介素(IL)是一類體內含量極微的細胞因子，多為小分子糖蛋白，在傳遞信息，激活與調節(jié)免疫細胞，介導T、B細胞活化、增殖與分化，以及在炎癥反應中均起著重要作用，目前已發(fā)現30多種。其中IL-12是由單核細胞、巨噬細胞分泌表達的一種細胞因子，具有多種生物學活性，在機體的抗腫瘤、抗病毒、抗過敏過程中均發(fā)揮著極其重要的作用，在臨床上有著巨大的應用前景[2]。目前，雖已有商品化的重組IL-12出售，但價格極其昂貴，因此利用植物生物反應器高效表達生產IL-12，降低IL-12的生產成本，具有重大的應用價值。

本實驗室前期研究中，構建了CaMV-35S啟動子驅動的hIL12表達載體并導入馬鈴薯基因組，獲得了表達hIL12的轉基因馬鈴薯植株，體外實驗表明重組hIL12具有生物學活性，但表達量較低[3-4]。利用植物自身的組織特異性強啟動子替代CaMV-35S等組成型啟動子來驅動外源基因的表達，是提高重組蛋白表達量的有效途徑[5]。馬鈴薯PATATIN蛋白是一類分子量約為40 kD的糖蛋白，其在馬鈴薯塊莖可溶性總蛋白中的含量高達40%，而在其它組織中的含量極少[6]。因此，本研究擬從馬鈴薯基因組中克隆驅動patatin基因高效表達的組織特異性啟動子(Ppatatin)，并對克隆的啟動子進行生物信息學分析，然后構建其驅動的植物表達載體，為其在馬鈴薯生物反應器中的應用和提高hIL12的表達量打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要試劑 本研究用馬鈴薯材料中薯1號，由遵義市農科所提供。主要試劑有PCR反應液(Takara公司)、限制性內切核酸酶及DNA連接酶(Takara公司)、質粒提取試劑盒(TIANGEN公司)、瓊脂糖(西班牙)等?？寺y序載體為pMD-18T，購買于Takara公司；雙元表達載體pCAMBIA2301-MCS由中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所贈送；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購于TIANGEN公司；質粒pIRES2-EGFP-hIL-12HSP70由本實驗室保存。所用PCR引物由上海生工公司合成，引物序列(見表1)。

表1引物序列

引物名稱引物序列 酶切位點Ppatatin-fCCGGAAGCTTTGCGTATTAGTTTTAGCGACGAHind IIIPpatatin-rCCCCGTCGACGTTGGTGCTTTGAGCATATAACSal IhIL12-fCAACGTCGACGGGGCAAGATGTGTCACCAGCAGSal IhIL12-rCCGGGAGCTCTTAGGAAGCATTCAGATAGCSac I

1.2 DNA提取 使用改良的CTAB法提取基因組DNA，取馬鈴薯塊莖0.5 g于液氮中研磨粉碎，轉入離心管，加入5 mL CTAB提取液，65 ℃加熱30 min后，12 000 rpm離心10min。取上清，加入等體積的酚/氯仿抽提2次，取上清并加入等體積的異丙醇常溫沉淀5 min，12 000 rpm離心5 min，棄上清，沉淀中加入5 mL 70%乙醇洗滌沉淀2次，最后完全棄除液體風干，加入100 μL TE/RNase緩沖液，-70 ℃保存。

1.3 PCR擴增 以基因組DNA或質粒為模板，利用表1的引物進行擴增。反應體系如下：模板50 ng、10×buffer 5 μL、dNTPs(10 mmol L-1)1 μL、引物(10 μmol L-1)各1 μL、Taq酶1 U、補水至50 μL。反應程序為：預變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50～58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；72 ℃充分延伸10 min。擴增循環(huán)數為26～30次。

1.4 啟動子序列分析 序列同源性分析比對在NCBI網站BLAST頁面(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)進行，啟動子核心區(qū)序列及相關調控元件分析利用數據庫Neural Network Promoter Prediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)以及植物順式調控元件數據庫PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/ signalscan.html)和PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare.html)完成。

1.5 表達載體構建 利用引物Ppatatin-f和Ppatatin-r從基因組DNA中擴增Ppatatin啟動子序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測后割膠回收并連接T載體，送予上海生工公司進行序列測定。利用引物IL12-f和IL12-r從本實驗室保存的pIRES2-EGFP-hIL-12HSP70載體中擴增出hIL12基因序列并回收。接著，以Ppatatin-f+hIL12-r為引物，以回收的Ppatatin啟動子片段和hIL12基因片段為模板，利用重疊PCR技術，擴增獲得Ppatatin啟動子+hIL12基因片段。用Hind III和SacI限制性內切酶酶切目的片段和表達載體pCAMBIA2301-MCS。回收相應片段后T4 DNA連接酶連接，熱激法轉化大腸桿菌DH5α，重組質粒轉化方法參見文獻[7]。挑取轉化子進行培養(yǎng)、酶切鑒定陽性克隆后，送予上海生工公司進行序列測定以確保序列正確，重組載體示意圖(見圖1)。

圖1 表達載體示意圖

2 結果

2.1 馬鈴薯基因組DNA提取和啟動子Ppatatin的獲得 利用CTAB法，順利提取了馬鈴薯基因組DNA(見圖2A)。為獲得最佳的PCR擴增效率，本研究對引物退火溫度進行了摸索并設計了退火溫度梯度，分別為55 、56、58、59 °C。結果顯示，退火溫度為55～56 °C時擴增效果最好，獲得了約1000 bp大小的Ppatatin條帶，且條帶整齊、亮度集中(見圖2B)。故以此為退火溫度進行大量擴增后回收片段，通過T-A克隆技術，將目的片段導入pMD-18T載體，酶切鑒定(圖2C)正確后進行測序分析。

A：馬鈴薯基因組DNA電泳圖，1：λDNA標準品(100 ng)；2：馬鈴薯基因組DNA；B：不同退火溫度下Ppatatin擴增效果；1～4分別是退火為55、56、58、59 °C時的PCR擴增條帶，箭頭所示為目標條帶，下同；C：pMD-18T- Ppatatin重組質粒Hind III+ Sal I雙酶切檢測電泳圖，1～4為不同單克隆。圖2 Ppatatin擴增與T-A克隆鑒定電泳圖

2.2 啟動子Ppatatin序列鑒定和元件分析 通過DNA 測序表明所克隆的Ppatatin啟動子序列大小為1019 bp，序列GC含量較低，僅為31.89%。搜索Genebank數據庫中的同源序列，表明本研究克隆的序列與GeneBank中已公布的同源序列的一致性為98%以上。采用Neural Network Promoter Prediction 啟動子數據庫進行功能預測，結果表明克隆到的Ppatatin序列存在2處核心啟動子區(qū)域(見表2)，并且得分較高(總分為1分)，表明該序列具有啟動子功能。

表2 Ppatatin序列的核心啟動子區(qū)

利用PLACE 及PlantCare 數據庫進行在線預測，分析啟動子的功能元件和重要調控區(qū)，結果顯示(見圖3)：在-52至-45 bp、-211至-205 bp以及-218至-213 bp處有3個TATA-box，其功能是保證轉錄得以精確起始；在-240至-235 bp及-405至-401 bp處有2個CAAT-box，決定著啟動子的起始頻率和強度。除了含有TATA-box和CAAT-box2個典型的啟動子元件外，該序列還有多個與糖響應相關元件，包括：2個SURE1和2個SURE2蔗糖效應元件，分別位于-193至-184 bp、-513至-504 bp以及-206至-196 bp、-526至-516 bp處，這4個元件是馬鈴薯塊莖中patatin基因啟動子的保守調控序列；另有2個CGACGOSAMY3糖相關元件，位于-12至-8 bp和-1003至-999 bp處。有2個莖部特異表達相關元件：NODCON1GM 和NODCON2GM，分別位于-668至-663 bp和-788至-784 bp處。還有4個與儲藏蛋白表達相關的EBOXBNNAPA順式元件，分別位于-951至-946 bp、-452至-447 bp、-419至-414 bp和-160至-155 bp處；以及2個儲藏物特異調控蛋白結合位點B-box，分別位于-604至-594 bp和-246至-236 bp處。此外，該序列中還發(fā)現了與調節(jié)植物生長發(fā)育相關的一些應激元件，例如：光反應元件ATCT-motif(-865至-856 bp)、AAAC-motif(-335至-324 bp)和G-box(-60至-55 bp)；與逆境相關的ABA應答元件ABRELATERD1(-770至-766 bp)等。以上分析結果表明該片段不僅具有完整的啟動子表達調控元件，還具有與組織特異性相關的特異序列，而這些序列也正是驅動馬鈴薯patatin基因特異性表達所必須的。

圖3 Ppatatin序列分析

2.3 表達載體的構建 本研究首先以pIRES2-EGFP-hIL-12HSP70載體質粒為模板，通過PCR擴增獲得了大小約為1.6 kb的hIL12基因片段(見圖4A，泳道2)。接著，利用重疊PCR技術，將Ppatatin片段和hIL12基因片段合成在一起，獲得了約2.6 kb的Ppatatin+hIL12基因片段(見圖4A，泳道3)。接著，通過雙酶切將母本載體pCambia2301-MCS上的CaMV-35S啟動子切下，結果顯示獲得了大小約為12 kb載體片段和600 bp的CaMV-35S片段(圖4B)，回收載體片段。通過體外連接，將Ppatatin+hIL12基因片段裝入表達載體(載體示意圖見圖1)。挑選7個轉化后的單克隆重組子提取質粒后進行限制性內切酶酶切鑒定，結果顯示(見圖4C)，重組子1、3、7、8的質粒經酶切后，檢測到了大小約12 kb的載體片段和2.5 kb的目的片段，表明其為陽性克隆，證實載體構建成功。

A：啟動子Ppatatin1、hIL12基因2和Ppatatin+hIL12 3片段電泳圖，條帶大小分別為1、1.6、2.6 kb；B：pCambia2301-MCS載體Hind III+ Sac I雙酶切電泳圖；C：重組表達載體Hind III+ Sac I雙酶切鑒定電泳圖，1～8為不同單克隆。圖4 表達載體構建與鑒定電泳圖

3 討論

目前，用于重組藥用蛋白研究和生產的生物反應器有原核生物反應器[8]、酵母生物反應器[9]、動物生物反應器[10]和植物生物反應器[1]。相比于微生物反應器，植物生物反應器由于具有與動物細胞相似的真核基因表達機制，表達的蛋白更易具有生物學活性；而和動物反應器相比，植物細胞培養(yǎng)簡單，且轉基因體系成熟。鑒于植物生物反應器的各種優(yōu)越性，開發(fā)植物生物反應器表達具有應用價值和應用潛力的藥用蛋白受到了許多科研工作者的重視[1, 5,11]。但是，相比于微生物反應器的高效性，植物表達系統(tǒng)的外源蛋白表達量太低[5， 12]，大大限制了其發(fā)展。啟動子是決定外源蛋白能否高表達的重要因素，而選擇利用組織特異性的強啟動子驅動外源基因，在植物的某一特定組織內獲得高表達重組蛋白，是優(yōu)化植物生物反應器的途徑之一[5]。因此，本研究選用馬鈴薯塊莖特異表達的高效啟動子Ppatatin驅動hIL12的表達，期望在下一步的研究中獲得馬鈴薯塊莖中特異性高表達的重組hIL12，在前期研究[3-4]的基礎上提高hIL12的表達量。

本研究通過Genebank數據庫搜索patatin基因及其啟動子序列，采用生物信息學分析和比較，設計特異性的引物從馬鈴薯品種中薯1號中成功獲得了大小為1019 bp的目的序列，經與數據庫同源序列比對表明patatin基因啟動子區(qū)序列呈現高度保守。通過生物信息學手段對該序列分析和預測，發(fā)現該序列具有2處核心啟動子區(qū)域，具有啟動子的特征。在序列結構上，該序列含有TATA-Box、CAAT-Box等轉錄起始必需元件外，含有4個蔗糖效應元件，2個糖相關元件，這和PATATIN蛋白的表達受到蔗糖誘導相符[13]。該序列還含有2個莖部特異表達相關元件、4個與儲藏蛋白表達相關元件以及2個儲藏物特異調控蛋白結合位點，符合PATATIN蛋白是馬鈴薯塊莖的儲藏蛋白這一特點[14]。

除了啟動子因素外，高效和穩(wěn)定的植物表達載體也是外源蛋白高表達的重要決定因素。本研究選用的pCambia系列載體是轉基因植物研究時最常用的表達載體，該載體含有左右2個T-DNA邊界，邊界內的序列能整合到植物基因組中的隨機位置[15-16]。本研究的基礎載體pCambia2301-MCS是在pCambia-2301的多克隆位點區(qū)加入了組成型啟動子CaMV-35S和NOS終止子。因此，本研究首先利用限制性內切酶將載體上的CaMV-35S啟動子切下后，再導入啟動子Ppatatin和hIL12基因片段。此外，本研究利用重疊PCR技術將Ppatatin片段和hILl2片段拼裝在一起后，將2個片段一步連接到母本載體，省去了一步體外連接及轉化的操作，簡化了載體構建過程。

綜上所述，本研究從馬鈴薯中克隆了塊莖特異性高表達的patatin基因啟動子并進行了生物信息學分析，然后成功構建了其驅動的hIL12植物表達載體，對提高hIL-12在馬鈴薯中的表達量和優(yōu)化馬鈴薯生物反應器中在藥用蛋白表達中的應用具有一定的意義。

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