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    堿液冷提法提取程海螺旋藻中的多糖

    2014-08-12 21:48:15李會(huì)端秦志玉
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年6期
    關(guān)鍵詞:提取工藝多糖

    李會(huì)端+秦志玉

    摘要:采用堿液冷提法提取程海螺旋藻中的多糖,用顯色法進(jìn)行定性檢驗(yàn),以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)照進(jìn)行測(cè)定提取液中多糖的含量并計(jì)算提取率。通過(guò)單因素試驗(yàn)初步探究了氫氧化鈉濃度、料液比、浸提時(shí)間3個(gè)試驗(yàn)條件對(duì)程海螺旋藻中多糖提取率的影響,通過(guò)正交試驗(yàn)最終確定堿液冷提法提取程海螺旋藻中多糖的最佳試驗(yàn)條件。試驗(yàn)結(jié)果表明,氫氧化鈉濃度0.4 mol/L、料液比1 ∶25、提取時(shí)間2 h為較佳提取條件,測(cè)得程海螺旋藻中多糖的提取率為4524%。

    關(guān)鍵詞:堿液冷提法;鈍頂螺旋藻;多糖;提取工藝;提取率

    中圖分類(lèi)號(hào): S937.3;R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2014)06-0255-03

    收稿日期:2013-09-23

    基金項(xiàng)目:云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(編號(hào):2012FD050);楚雄師范學(xué)院科學(xué)研究基金(編號(hào):11YJGG01)。

    作者簡(jiǎn)介:李會(huì)端(1983—),女,河北寧晉人,博士研究生,講師,主要從事天然產(chǎn)物的化學(xué)成分分析及應(yīng)用研究。 E-mail:lhd08@cxtc.edu.cn。多糖是指由10個(gè)以上的單糖通過(guò)糖苷鍵連成的高分子聚合物,是生命賴以存在的四大基本物質(zhì)之一,按其來(lái)源可分為植物多糖、動(dòng)物多糖、微生物多糖、藻類(lèi)多糖,其中植物多糖和微生物多糖研究較多,藻類(lèi)多糖研究相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)藻類(lèi)多糖具有顯著的抗病毒、抗腫瘤功能,能抑制癌細(xì)胞合成和增殖,提高肌體免疫力,從藻類(lèi)中提取的多糖類(lèi)藥物具有顯著的抗艾滋病的功效[1]。對(duì)多糖的研究已成為21世紀(jì)醫(yī)藥界的熱門(mén)領(lǐng)域。螺旋藻屬于藍(lán)藻門(mén)藍(lán)藻綱螺旋藻屬,螺旋藻含有多種生物活性物質(zhì),具有重要的保健功能和藥用價(jià)值,在食品保健、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)有廣泛應(yīng)用[2]。多糖類(lèi)化合物是螺旋藻中重要的生物活性物質(zhì)之一,對(duì)其進(jìn)行提取和應(yīng)用開(kāi)發(fā)研究具有重要的研究?jī)r(jià)值。多糖類(lèi)化合物的提取方法有熱水浸提法、堿液冷提法、酸浸提法、酶解法和超聲提取法[3]。螺旋藻呈弱堿性,不宜采用酸浸提法,而螺旋藻種類(lèi)和提取方法不同,多糖提取率有很大差異[4-7]。本研究選用麗江程海螺旋藻(屬于鈍頂螺旋藻)為原料,用堿液冷提法提取螺旋藻中的多糖,顯色反應(yīng)進(jìn)行定性檢驗(yàn),優(yōu)化提取條件,從而確定較佳的提取工藝,以期為程海螺旋藻的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

    1材料與方法

    1.1材料與試劑

    麗江程海螺旋藻干粉由麗江永程生物科技開(kāi)發(fā)有限公司提供,置于恒溫干燥箱中干燥至恒重備用。

    葡萄糖(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、苯酚(廣東光華科技股份有限公司)、硫酸(成都市科龍化工試劑廠)、氫氧化鈉(廣東光華科技股份有限公司)、三氯乙酸(廣東光華化學(xué)廠有限公司)、95%乙醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、無(wú)水乙醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、丙酮(成都市科龍化工試劑廠),以上試劑均為分析純。

    1.2儀器與設(shè)備

    722型光柵分光光度計(jì)(山東高密分析儀器廠)、80-2離心機(jī)(江蘇大地自動(dòng)化儀器廠)、SHZ-S2S循環(huán)水式真空泵(鞏義市大地自動(dòng)化儀器廠)、電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)。

    1.3試驗(yàn)方法

    1.3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.0200 g,在燒杯中用蒸餾水溶解,再轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中稀釋定容,配制成0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,備用。

    1.3.2苯酚溶液的配制用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取5.000 0 g苯酚,在燒杯中用蒸餾水溶解,再轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中稀釋定容,配制成5%的苯酚溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

    1.3.3測(cè)定方法依據(jù)以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液為對(duì)照品測(cè)定螺旋藻中多糖的含量,加入苯酚和濃硫酸,使多糖在硫酸的作用下先水解成單糖,并迅速脫水生成糖醛衍生物,然后與苯酚生成橙黃色化合物,在可見(jiàn)光區(qū)獲得穩(wěn)定的特征吸收峰。

    1.3.4螺旋藻中多糖提取率計(jì)算方法

    多糖提取率=稀釋倍數(shù)×測(cè)定溶液濃度×容量瓶體積樣品質(zhì)量×100%

    將吸光度代入線性回歸方程,計(jì)算提取液濃度,再代入上式計(jì)算螺旋藻中多糖提取率。

    2試驗(yàn)與結(jié)果分析

    2.1最大吸收波長(zhǎng)的確定

    用吸量管分別移取1.00 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、螺旋藻提取液于2支25 mL比色管中,分別加入5%苯酚溶液 1.00 mL,再迅速滴加濃硫酸5.00 mL,混合搖勻,用蒸餾水稀釋定容至10 mL刻度,靜置冷卻至室溫。以試劑空白作對(duì)照,在400~550 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)吸光度,確定最大吸收峰波長(zhǎng)。

    吸光度測(cè)定掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。初始階段,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和螺旋藻提取液的吸光度都隨著測(cè)定波長(zhǎng)的增加而增大,當(dāng)波長(zhǎng)增加到490 nm時(shí)兩者都達(dá)到最大吸收峰值,而后隨著波長(zhǎng)增加,吸收峰開(kāi)始減小,因此選擇490 nm為最大吸收波長(zhǎng),此后的吸光度均在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定。

    2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    用吸量管分別移取0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于6支25 mL比色管中,各加入5% 苯酚溶液1.00 mL,再迅速滴加濃硫酸 5.00 mL,混合搖勻,用蒸餾水稀釋定容至10 mL刻度,靜置冷卻至室溫,以第1支比色管為空白對(duì)照,在最大吸收峰波長(zhǎng)處(490 nm)用722型光柵分光光度計(jì)測(cè)量吸光度。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖2所示。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性回歸方程為y=8.862 86x-0.0208 7,相關(guān)系數(shù) r=0.998 6。其中y為吸光度,x為提取液中多糖的濃度。

    2.3多糖定性試驗(yàn)

    苯酚-硫酸反應(yīng):取幾滴螺旋藻提取液于試管中,用膠頭滴管滴加3~5滴5%苯酚溶液,混合搖勻后再滴加3~5滴濃硫酸,觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。endprint

    蒽酮-硫酸反應(yīng):取幾滴螺旋藻提取液于試管中,用膠頭滴管滴加3~5滴蒽酮溶液,混合搖勻后再滴加3~5滴濃硫酸,觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

    α-萘酚-硫酸反應(yīng):取幾滴螺旋藻提取液于試管中,用膠頭滴管滴加3~5滴α-萘酚溶液,混合搖勻后再滴加3~5滴濃硫酸,觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

    將螺旋藻提取液多糖定性試驗(yàn)結(jié)果列于表1。螺旋藻提取液反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果均與多糖類(lèi)化合物顯色反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果相同,證明螺旋藻提取液中含多糖類(lèi)化合物。

    螺旋藻提取液多糖定性試驗(yàn)結(jié)果

    試劑苯酚-硫酸蒽酮-硫酸α-萘酚-硫酸現(xiàn)象溶液顏色由無(wú)

    色變成橙紅色溶液顏色呈墨

    綠色有紫紅色環(huán)產(chǎn)生

    2.4單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

    2.4.1氫氧化鈉濃度對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.000 0 g干燥至恒重的螺旋藻粉末,分別用30 mL不同濃度的氫氧化鈉溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L)浸提2 h,過(guò)濾,將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL,待其冷卻至室溫,加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液,振蕩5 min使其混合均勻,再靜置5 h(除蛋白質(zhì)),將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液,加入80 mL 95%乙醇,靜置過(guò)夜(進(jìn)行醇沉),以4 000 r/min離心10 min,棄上清液,依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次,將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容,測(cè)其吸光度,計(jì)算提取液中多糖的提取率。氫氧化鈉濃度對(duì)多糖提取率影響結(jié)果如圖3所示。

    開(kāi)始階段,隨著提取液氫氧化鈉溶液濃度的增加,多糖提取率也不斷增加,當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度超過(guò)0.4 mol/L,多糖提取率開(kāi)始降低。堿液浸提有助于破壞細(xì)胞壁聚合物分子的結(jié)構(gòu),從而提高多糖提取率,但堿液濃度過(guò)高則與多糖類(lèi)化合物發(fā)生脫酯反應(yīng)和消去反應(yīng)從而破壞多糖結(jié)構(gòu),根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,最終確定0. 4mol/L為較佳的氫氧化鈉提取液濃度。

    2.4.2料液比對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000 g干燥至恒重的螺旋藻粉末,固定提取液氫氧化鈉溶液的濃度為0.4 mol/L,調(diào)變料液比分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL,堿液浸提2 h,過(guò)濾,將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL,待其冷卻至室溫,加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液,振蕩5 min,再靜置5 h(除蛋白質(zhì)),將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液,加入 80 mL 95%乙醇,靜置過(guò)夜(進(jìn)行醇沉),以4 000 r/min離心10 min棄去上清液,依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次,將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容,測(cè)其吸光度,計(jì)算提取液中多糖的提取率。料液比對(duì)螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果如圖4所示。

    開(kāi)始階段,隨著料液比的增加,多糖提取率也不斷增加,當(dāng)料液比超過(guò)1 g ∶25 mL后,多糖提取率開(kāi)始降低。料液比越大,螺旋藻細(xì)胞壁作為半透膜兩側(cè)多糖濃度差越大,有利于多糖浸出,但料液比太大,使得多糖在蒸發(fā)濃縮過(guò)程中損失加劇,從而降低多糖提取率。綜合考慮,選取1 g ∶25 mL為多糖提取的較佳料液比。

    2.4.3浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000g干燥至恒重的螺旋藻粉末,用50mL濃度為

    0.4 mol/L 的氫氧化鈉溶液分別浸提0.5、1、1.5、2、2.5 h,過(guò)濾,將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL,待其冷卻至室溫加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液,振蕩5 min,再靜置5 h(除蛋白質(zhì)),將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液,加入80 mL 95%乙醇,靜置過(guò)夜(進(jìn)行醇沉),以 4 000 r/min 離心10 min棄去上清液,依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次,將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶定容,測(cè)其吸光度,計(jì)算提取液中多糖的提取率。浸提時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

    浸提時(shí)間延長(zhǎng),多糖提取率也逐漸增加,當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)1.5 h后,多糖提取率開(kāi)始降低。原因可能是隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng),部分多糖降解為可溶于乙醇的單糖、寡糖或低聚糖,在醇沉過(guò)程中溶解損失,導(dǎo)致多糖提取率降低。綜上試驗(yàn),選取1.5 h為螺旋藻中多糖提取的較佳浸提時(shí)間。

    2.5正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以氫氧化鈉溶液濃度、料液比、浸提時(shí)間為變量,多糖提取率為考察指標(biāo),考察這3個(gè)變量因素對(duì)多糖提取率的影響。設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn),因素水平和正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

    3結(jié)果與分析

    本研究選用堿液浸提的方法,初步探究了氫氧化鈉溶液

    提取率(%)11 113.61021224.20231333.81942124.11252234.52462313.98273134.07283214.32193324.242k111.63111.79411.913k212.61813.04712.556k312.63512.04312.415極差R1.004 1.2530.643主次順序B>A>C優(yōu)水平A2 B2C3優(yōu)組合A2B2C3

    濃度、料液比、浸提時(shí)間3個(gè)因素對(duì)程海螺旋藻多糖提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn),3個(gè)因素對(duì)程海螺旋藻中多糖提取率均有影響,影響程度依次為:B(料液比)>A(提取液濃度)>C(提取時(shí)間)。以多糖提取率為考察指標(biāo),最優(yōu)試驗(yàn)條件組合為A2B2C3,氫氧化鈉溶液濃度為0.4 mol/L、料液比為1 g ∶25 mL、浸提時(shí)間為2 h,程海螺旋藻中多糖提取率為4.524%。

    曲阜師范大學(xué)的研究人員報(bào)道了極大螺旋藻中多糖的提取率為3.935%[8];南京中醫(yī)藥大學(xué)的研究人員報(bào)道了鹽澤螺旋藻中多糖的提取率約為27%[9]。對(duì)比發(fā)現(xiàn),鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻的多糖含量低,但相差不大,而鹽澤螺旋藻的多糖含量相對(duì)較高。

    參考文獻(xiàn):

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    蒽酮-硫酸反應(yīng):取幾滴螺旋藻提取液于試管中,用膠頭滴管滴加3~5滴蒽酮溶液,混合搖勻后再滴加3~5滴濃硫酸,觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

    α-萘酚-硫酸反應(yīng):取幾滴螺旋藻提取液于試管中,用膠頭滴管滴加3~5滴α-萘酚溶液,混合搖勻后再滴加3~5滴濃硫酸,觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

    將螺旋藻提取液多糖定性試驗(yàn)結(jié)果列于表1。螺旋藻提取液反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果均與多糖類(lèi)化合物顯色反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果相同,證明螺旋藻提取液中含多糖類(lèi)化合物。

    螺旋藻提取液多糖定性試驗(yàn)結(jié)果

    試劑苯酚-硫酸蒽酮-硫酸α-萘酚-硫酸現(xiàn)象溶液顏色由無(wú)

    色變成橙紅色溶液顏色呈墨

    綠色有紫紅色環(huán)產(chǎn)生

    2.4單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

    2.4.1氫氧化鈉濃度對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.000 0 g干燥至恒重的螺旋藻粉末,分別用30 mL不同濃度的氫氧化鈉溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L)浸提2 h,過(guò)濾,將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL,待其冷卻至室溫,加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液,振蕩5 min使其混合均勻,再靜置5 h(除蛋白質(zhì)),將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液,加入80 mL 95%乙醇,靜置過(guò)夜(進(jìn)行醇沉),以4 000 r/min離心10 min,棄上清液,依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次,將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容,測(cè)其吸光度,計(jì)算提取液中多糖的提取率。氫氧化鈉濃度對(duì)多糖提取率影響結(jié)果如圖3所示。

    開(kāi)始階段,隨著提取液氫氧化鈉溶液濃度的增加,多糖提取率也不斷增加,當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度超過(guò)0.4 mol/L,多糖提取率開(kāi)始降低。堿液浸提有助于破壞細(xì)胞壁聚合物分子的結(jié)構(gòu),從而提高多糖提取率,但堿液濃度過(guò)高則與多糖類(lèi)化合物發(fā)生脫酯反應(yīng)和消去反應(yīng)從而破壞多糖結(jié)構(gòu),根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,最終確定0. 4mol/L為較佳的氫氧化鈉提取液濃度。

    2.4.2料液比對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000 g干燥至恒重的螺旋藻粉末,固定提取液氫氧化鈉溶液的濃度為0.4 mol/L,調(diào)變料液比分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL,堿液浸提2 h,過(guò)濾,將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL,待其冷卻至室溫,加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液,振蕩5 min,再靜置5 h(除蛋白質(zhì)),將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液,加入 80 mL 95%乙醇,靜置過(guò)夜(進(jìn)行醇沉),以4 000 r/min離心10 min棄去上清液,依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次,將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容,測(cè)其吸光度,計(jì)算提取液中多糖的提取率。料液比對(duì)螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果如圖4所示。

    開(kāi)始階段,隨著料液比的增加,多糖提取率也不斷增加,當(dāng)料液比超過(guò)1 g ∶25 mL后,多糖提取率開(kāi)始降低。料液比越大,螺旋藻細(xì)胞壁作為半透膜兩側(cè)多糖濃度差越大,有利于多糖浸出,但料液比太大,使得多糖在蒸發(fā)濃縮過(guò)程中損失加劇,從而降低多糖提取率。綜合考慮,選取1 g ∶25 mL為多糖提取的較佳料液比。

    2.4.3浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000g干燥至恒重的螺旋藻粉末,用50mL濃度為

    0.4 mol/L 的氫氧化鈉溶液分別浸提0.5、1、1.5、2、2.5 h,過(guò)濾,將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL,待其冷卻至室溫加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液,振蕩5 min,再靜置5 h(除蛋白質(zhì)),將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液,加入80 mL 95%乙醇,靜置過(guò)夜(進(jìn)行醇沉),以 4 000 r/min 離心10 min棄去上清液,依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次,將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶定容,測(cè)其吸光度,計(jì)算提取液中多糖的提取率。浸提時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

    浸提時(shí)間延長(zhǎng),多糖提取率也逐漸增加,當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)1.5 h后,多糖提取率開(kāi)始降低。原因可能是隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng),部分多糖降解為可溶于乙醇的單糖、寡糖或低聚糖,在醇沉過(guò)程中溶解損失,導(dǎo)致多糖提取率降低。綜上試驗(yàn),選取1.5 h為螺旋藻中多糖提取的較佳浸提時(shí)間。

    2.5正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以氫氧化鈉溶液濃度、料液比、浸提時(shí)間為變量,多糖提取率為考察指標(biāo),考察這3個(gè)變量因素對(duì)多糖提取率的影響。設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn),因素水平和正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

    3結(jié)果與分析

    本研究選用堿液浸提的方法,初步探究了氫氧化鈉溶液

    提取率(%)11 113.61021224.20231333.81942124.11252234.52462313.98273134.07283214.32193324.242k111.63111.79411.913k212.61813.04712.556k312.63512.04312.415極差R1.004 1.2530.643主次順序B>A>C優(yōu)水平A2 B2C3優(yōu)組合A2B2C3

    濃度、料液比、浸提時(shí)間3個(gè)因素對(duì)程海螺旋藻多糖提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn),3個(gè)因素對(duì)程海螺旋藻中多糖提取率均有影響,影響程度依次為:B(料液比)>A(提取液濃度)>C(提取時(shí)間)。以多糖提取率為考察指標(biāo),最優(yōu)試驗(yàn)條件組合為A2B2C3,氫氧化鈉溶液濃度為0.4 mol/L、料液比為1 g ∶25 mL、浸提時(shí)間為2 h,程海螺旋藻中多糖提取率為4.524%。

    曲阜師范大學(xué)的研究人員報(bào)道了極大螺旋藻中多糖的提取率為3.935%[8];南京中醫(yī)藥大學(xué)的研究人員報(bào)道了鹽澤螺旋藻中多糖的提取率約為27%[9]。對(duì)比發(fā)現(xiàn),鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻的多糖含量低,但相差不大,而鹽澤螺旋藻的多糖含量相對(duì)較高。

    參考文獻(xiàn):

    [1]孫遠(yuǎn)征,張學(xué)成,紀(jì)雷. 鈍頂螺旋藻多糖提取工藝的研究——三氯乙酸(TCA)法的正交試驗(yàn)優(yōu)化[J]. 海洋科學(xué),2007,31(4):42-47.

    [2]陸杰. 淺談螺旋藻[J]. 醫(yī)藥化工,2008(9):33-36.

    [3]馮婷,何聰芬,趙華,等. 植物多糖研究概況[J]. 北京工商大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,22(5):1-4.

    [4]張文雄,覃海錯(cuò),黃文榜,等. 螺旋藻粗多糖提取工藝研究[J]. 廣西化工,1999,28(1):13-16.

    [5]夏冰,郭育濤. 螺旋藻多糖粗提方法的工藝條件研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,16(11):40-41,92.

    [6]高憲軍,段濤,王承明. 堿提棉籽粕多糖工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技,2010,31(11):258-261.

    [7]賁永光,鐘紅茂,李康,等. 超聲輔助提取螺旋藻多糖的試驗(yàn)研究[J]. 中成藥,2011,33(6):1078-1080.

    [8]孫鵬. 極大螺旋藻多糖提取方法研究[J]. 科技情報(bào)開(kāi)發(fā)與經(jīng)濟(jì),2011,21(11):184-186.

    [9]于光,馬宇翔. 鹽澤螺旋藻多糖的最佳獲取條件[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(23):108-111.呂興萍,楊薇紅,馬春嬌. 響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取靈芝多糖工藝條件[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(6):258-260.endprint

    蒽酮-硫酸反應(yīng):取幾滴螺旋藻提取液于試管中,用膠頭滴管滴加3~5滴蒽酮溶液,混合搖勻后再滴加3~5滴濃硫酸,觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

    α-萘酚-硫酸反應(yīng):取幾滴螺旋藻提取液于試管中,用膠頭滴管滴加3~5滴α-萘酚溶液,混合搖勻后再滴加3~5滴濃硫酸,觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

    將螺旋藻提取液多糖定性試驗(yàn)結(jié)果列于表1。螺旋藻提取液反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果均與多糖類(lèi)化合物顯色反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果相同,證明螺旋藻提取液中含多糖類(lèi)化合物。

    螺旋藻提取液多糖定性試驗(yàn)結(jié)果

    試劑苯酚-硫酸蒽酮-硫酸α-萘酚-硫酸現(xiàn)象溶液顏色由無(wú)

    色變成橙紅色溶液顏色呈墨

    綠色有紫紅色環(huán)產(chǎn)生

    2.4單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

    2.4.1氫氧化鈉濃度對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.000 0 g干燥至恒重的螺旋藻粉末,分別用30 mL不同濃度的氫氧化鈉溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L)浸提2 h,過(guò)濾,將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL,待其冷卻至室溫,加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液,振蕩5 min使其混合均勻,再靜置5 h(除蛋白質(zhì)),將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液,加入80 mL 95%乙醇,靜置過(guò)夜(進(jìn)行醇沉),以4 000 r/min離心10 min,棄上清液,依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次,將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容,測(cè)其吸光度,計(jì)算提取液中多糖的提取率。氫氧化鈉濃度對(duì)多糖提取率影響結(jié)果如圖3所示。

    開(kāi)始階段,隨著提取液氫氧化鈉溶液濃度的增加,多糖提取率也不斷增加,當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度超過(guò)0.4 mol/L,多糖提取率開(kāi)始降低。堿液浸提有助于破壞細(xì)胞壁聚合物分子的結(jié)構(gòu),從而提高多糖提取率,但堿液濃度過(guò)高則與多糖類(lèi)化合物發(fā)生脫酯反應(yīng)和消去反應(yīng)從而破壞多糖結(jié)構(gòu),根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,最終確定0. 4mol/L為較佳的氫氧化鈉提取液濃度。

    2.4.2料液比對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000 g干燥至恒重的螺旋藻粉末,固定提取液氫氧化鈉溶液的濃度為0.4 mol/L,調(diào)變料液比分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL,堿液浸提2 h,過(guò)濾,將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL,待其冷卻至室溫,加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液,振蕩5 min,再靜置5 h(除蛋白質(zhì)),將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液,加入 80 mL 95%乙醇,靜置過(guò)夜(進(jìn)行醇沉),以4 000 r/min離心10 min棄去上清液,依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次,將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容,測(cè)其吸光度,計(jì)算提取液中多糖的提取率。料液比對(duì)螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果如圖4所示。

    開(kāi)始階段,隨著料液比的增加,多糖提取率也不斷增加,當(dāng)料液比超過(guò)1 g ∶25 mL后,多糖提取率開(kāi)始降低。料液比越大,螺旋藻細(xì)胞壁作為半透膜兩側(cè)多糖濃度差越大,有利于多糖浸出,但料液比太大,使得多糖在蒸發(fā)濃縮過(guò)程中損失加劇,從而降低多糖提取率。綜合考慮,選取1 g ∶25 mL為多糖提取的較佳料液比。

    2.4.3浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000g干燥至恒重的螺旋藻粉末,用50mL濃度為

    0.4 mol/L 的氫氧化鈉溶液分別浸提0.5、1、1.5、2、2.5 h,過(guò)濾,將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL,待其冷卻至室溫加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液,振蕩5 min,再靜置5 h(除蛋白質(zhì)),將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min,取上清液,加入80 mL 95%乙醇,靜置過(guò)夜(進(jìn)行醇沉),以 4 000 r/min 離心10 min棄去上清液,依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次,將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶定容,測(cè)其吸光度,計(jì)算提取液中多糖的提取率。浸提時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

    浸提時(shí)間延長(zhǎng),多糖提取率也逐漸增加,當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)1.5 h后,多糖提取率開(kāi)始降低。原因可能是隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng),部分多糖降解為可溶于乙醇的單糖、寡糖或低聚糖,在醇沉過(guò)程中溶解損失,導(dǎo)致多糖提取率降低。綜上試驗(yàn),選取1.5 h為螺旋藻中多糖提取的較佳浸提時(shí)間。

    2.5正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以氫氧化鈉溶液濃度、料液比、浸提時(shí)間為變量,多糖提取率為考察指標(biāo),考察這3個(gè)變量因素對(duì)多糖提取率的影響。設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn),因素水平和正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

    3結(jié)果與分析

    本研究選用堿液浸提的方法,初步探究了氫氧化鈉溶液

    提取率(%)11 113.61021224.20231333.81942124.11252234.52462313.98273134.07283214.32193324.242k111.63111.79411.913k212.61813.04712.556k312.63512.04312.415極差R1.004 1.2530.643主次順序B>A>C優(yōu)水平A2 B2C3優(yōu)組合A2B2C3

    濃度、料液比、浸提時(shí)間3個(gè)因素對(duì)程海螺旋藻多糖提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn),3個(gè)因素對(duì)程海螺旋藻中多糖提取率均有影響,影響程度依次為:B(料液比)>A(提取液濃度)>C(提取時(shí)間)。以多糖提取率為考察指標(biāo),最優(yōu)試驗(yàn)條件組合為A2B2C3,氫氧化鈉溶液濃度為0.4 mol/L、料液比為1 g ∶25 mL、浸提時(shí)間為2 h,程海螺旋藻中多糖提取率為4.524%。

    曲阜師范大學(xué)的研究人員報(bào)道了極大螺旋藻中多糖的提取率為3.935%[8];南京中醫(yī)藥大學(xué)的研究人員報(bào)道了鹽澤螺旋藻中多糖的提取率約為27%[9]。對(duì)比發(fā)現(xiàn),鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻的多糖含量低,但相差不大,而鹽澤螺旋藻的多糖含量相對(duì)較高。

    參考文獻(xiàn):

    [1]孫遠(yuǎn)征,張學(xué)成,紀(jì)雷. 鈍頂螺旋藻多糖提取工藝的研究——三氯乙酸(TCA)法的正交試驗(yàn)優(yōu)化[J]. 海洋科學(xué),2007,31(4):42-47.

    [2]陸杰. 淺談螺旋藻[J]. 醫(yī)藥化工,2008(9):33-36.

    [3]馮婷,何聰芬,趙華,等. 植物多糖研究概況[J]. 北京工商大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,22(5):1-4.

    [4]張文雄,覃海錯(cuò),黃文榜,等. 螺旋藻粗多糖提取工藝研究[J]. 廣西化工,1999,28(1):13-16.

    [5]夏冰,郭育濤. 螺旋藻多糖粗提方法的工藝條件研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,16(11):40-41,92.

    [6]高憲軍,段濤,王承明. 堿提棉籽粕多糖工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技,2010,31(11):258-261.

    [7]賁永光,鐘紅茂,李康,等. 超聲輔助提取螺旋藻多糖的試驗(yàn)研究[J]. 中成藥,2011,33(6):1078-1080.

    [8]孫鵬. 極大螺旋藻多糖提取方法研究[J]. 科技情報(bào)開(kāi)發(fā)與經(jīng)濟(jì),2011,21(11):184-186.

    [9]于光,馬宇翔. 鹽澤螺旋藻多糖的最佳獲取條件[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(23):108-111.呂興萍,楊薇紅,馬春嬌. 響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取靈芝多糖工藝條件[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(6):258-260.endprint

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