CIK逆轉(zhuǎn)耐順鉑人肺腺癌細(xì)胞對順鉑耐藥與ERCC1的相關(guān)性

田 昕，李 寧，李 冉

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院 胸部腫瘤科，貴州 遵義 563099)

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，目前缺乏簡單有效的早期檢查方法，因此，約2/3的患者確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無手術(shù)機(jī)會，化療是其主要的治療手段，化療耐藥是亟待解決的問題。腫瘤耐藥是多因素參與的過程，其生物化學(xué)機(jī)制有很多，DNA修復(fù)機(jī)制是目前研究較多的機(jī)制之一，核酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair,NSE)為DNA修復(fù)的限速步驟，ERCC1為NES中DNA損傷識別和鏈間切割的關(guān)鍵基因，ERCC1表達(dá)上調(diào)可致腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)加快，導(dǎo)致耐藥[1]。細(xì)胞因子活化的殺傷細(xì)胞被認(rèn)為是新一代腫瘤過繼治療的首選方案之一。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CIK能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，其逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制涉及了多種蛋白質(zhì)及通路的改變， ERCC1作為介導(dǎo)耐藥的重要基因，是否也能被CIK所改變從而實(shí)現(xiàn)耐藥的逆轉(zhuǎn)，是我們需要思考的問題。因此，本研究通過在體外用CIK作用于A549/DDP細(xì)胞，檢測其ERCC1 mRNA及蛋白的表達(dá)情況，與未予CIK干預(yù)組進(jìn)行比較，明確CIK對A549/DDP細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，并探討這種逆轉(zhuǎn)作用是否與ERCC1有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 A549細(xì)胞和 A549/DDP細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑及儀器 iMarkTMMicroplate Reader、

MINI電泳系統(tǒng)、Chemi DosXRS電泳凝膠成像分析系統(tǒng)，BIO-RAD公司；ND-2000核酸蛋白測定儀，Thermo公司；注射用順鉑(凍干型)，齊魯制藥有限公司；MTT，solarbio公司；抗人CD3單克隆抗體、IFN-γ、IL-2，sigma-aldrich 公司；IL-1α，prospec公司；人淋巴細(xì)胞分離液，天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；RNAiso Plus、Real-Time RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara公司；ERCC1 Rabbit Antibody，Cell Signaling Technology公司；Rabbit Anti-beta Actin Monoclonal Antibody，Beyotime公司；山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記，中杉金橋生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，Beyotime公司。PCR引物，由TaKaRa公司合成(見表1)。

表1基因引物序列

基因編號 名稱 堿基序列產(chǎn)物大小NM-001983.3ERCC1上游 5'-TACAAGGCCTATGAGCAGAAACCAG-3'25下游 5'-ACTTCACGGTGGTCAGACATTCAG-3'24NM-002046.4GAPDH上游 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'20下游 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'19?

1.2 方法

1.2.1 A549及A549/DDP細(xì)胞的培養(yǎng) A549細(xì)胞及A549/DDP細(xì)胞均采用改良型RPMI-1640培養(yǎng)基，向其中加入胎牛血清及青鏈霉素配制的雙抗，置于37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)及培養(yǎng) 于我院產(chǎn)科手術(shù)室無菌條件下采集臍血約50 mL，肝素抗凝，于超凈臺內(nèi)將臍血緩慢加入到盛有人淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，臍血與人淋巴細(xì)胞分離液的比例約為2∶1，放入低速冷凍離心機(jī)中離心2 000 r/min，25 min。然后吸取中間白膜層，加入5倍體積PBS重懸細(xì)胞，1 500 r/min，10 min，洗滌細(xì)胞，最后以含5%AB型血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，分裝入培養(yǎng)瓶中，在第0天向其中加入IFN-γ，使其終濃度為1 000 U/mL，第1天加入抗人CD3單克隆抗體、IL-1α、IL-2，使其終濃度分別為5 μL/106個(gè)細(xì)胞、100、300 U/mL。之后每3 天更換新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)補(bǔ)加IL-2，并調(diào)整細(xì)胞濃度。置于37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，2周后收獲細(xì)胞。

1.2.3 MTT法檢測耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù) ①取對數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL，以每孔100 μL接種于96 孔培養(yǎng)板，置于37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日早上向其中加入CIK細(xì)胞，效靶比分別為5∶1；10∶1；20∶1；40∶1；80∶1，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)對照組和調(diào)零組(對照組不加CIK細(xì)胞，加等體積培養(yǎng)液，調(diào)零組不接種細(xì)胞，余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同)置37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔吸光度值，通過線性回歸計(jì)算出IC10值。②分別取對數(shù)生長期的A549及A549/DDP細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL，以每孔100μL接種于96 孔培養(yǎng)板，其中， A549/DDP細(xì)胞接種于2個(gè)96 孔培養(yǎng)板，設(shè)置調(diào)零孔，不加細(xì)胞，加入等體積培養(yǎng)液。置于37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日向已接種A549細(xì)胞 及1個(gè)A549/DDP細(xì)胞的96 孔培養(yǎng)板中加入不同濃度的順鉑(0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL)，各100 μL，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，對照孔加入無菌PBS，置37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT20 μL，置孵箱中孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去上清液，每孔加150μLDMSO，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔吸光度值，計(jì)算抑制率(inhibition，IR)和耐藥指數(shù)(resistance index，RI)。IR=[1-(用藥組OD值-空白對照組OD值)/(對照組OD值-空白對照組OD值)]×100%；RI=耐藥細(xì)胞株IC50值/敏感細(xì)胞株IC50值；藥物半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)通過藥物對細(xì)胞的抑制率和藥物濃度的對數(shù)作圖求出。③另一個(gè)接種A549/DDP細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，于次日加入CIK(通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出CIK的IC10效靶比為10.44∶1，故設(shè)定效靶比為10∶1，作為無毒劑量逆轉(zhuǎn)耐藥)。作用24 h后再加入不同濃度順鉑，對照組不加CIK，加等體積培養(yǎng)液，測其OD值，計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(reversal fold，RF)=耐藥株IC50(不加CIK)/耐藥株IC50(加CIK)。

1.2.4 Real time PCR檢測ERCC1 mRNA表達(dá) 收集對數(shù)生長期的A549細(xì)胞、A549/DDP細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以每孔2.5mL體積接種至6孔培養(yǎng)板中，置37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞長滿孔底時(shí)，向A549/DDP細(xì)胞的3個(gè)孔中加入無毒劑量的CIK細(xì)胞(效靶比為10∶1)，其余各孔加入等體積培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。加Trizol裂解細(xì)胞，再向各管加100 μL三氯甲烷，震蕩后于4 ℃，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至新的去酶EP管中，加入等體積異丙醇，輕微振勻，靜置5 min后于4 ℃，12 000 r/min離心10 min，離心后RNA形成白色乳膠狀沉淀沉于管底。棄去上清，將EP管倒置于濾紙上，空干，各管加入75%乙醇清洗RNA沉淀，重復(fù)2次。室溫空干，加入DEPC水溶解RNA，核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度。分別取少量RNA母液，均用DEPC水稀釋至50 ng/μL，按20 μL反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?cDNA樣品配置15 μL實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系，置于Real-time PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 2min預(yù)變性，然后按95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40做個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min，最后55 ℃ 14 min。

1.2.5 Western blot檢測ERCC1蛋白表達(dá) A549/DDP細(xì)胞消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整兩瓶細(xì)胞數(shù)一致，向其中一個(gè)培養(yǎng)瓶中加入無毒劑量的CIK細(xì)胞(效靶比10∶1)，另一培養(yǎng)瓶加等體積培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌細(xì)胞3遍，吸干液體后每瓶加入400 μL含PMSF的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，然后用細(xì)胞刮和微量加樣器將裂解液移至EP管中，離心，4 ℃，12 000 r/min，5 min，最后將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。重?fù)上述方法收集蛋白樣本，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)SDS-PAGE凝膠配制試劑盒取說明配膠，取蛋白上樣量為50 ng，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗和孵育二抗，最后采用凝膠成像系統(tǒng)曝光。

1.2.6 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞對A549/DDP細(xì)胞的殺傷作用 CIK細(xì)胞分別以5∶1；10∶1；20∶1；40∶1；80∶1的效靶比作用于A549/DDP細(xì)胞，作用24 h后通過MTT計(jì)算出CIK細(xì)胞對A549/DDP細(xì)胞的抑制率(見表2)，隨著效靶比的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。通過線性回歸計(jì)算出CIK對A549/DDP細(xì)胞的IC10效靶比為10.44∶1。

CIK:A549/DDP抑制率5∶110∶120∶140∶180∶10.045±0.0110.090±0.0110.197±0.0210.389±0.0370.520±0.030

2.2 順鉑對各組細(xì)胞的抑制作用 順鉑對各組細(xì)胞的抑制率(見表3)。MTT數(shù)據(jù)表明，在不同濃度順鉑作用24 h后，抑制率呈濃度依賴性增加。DDP對A549細(xì)胞的抑制作用較A549/DDP 細(xì)胞更為顯著，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。加效靶比為10∶1的CIK預(yù)處理的A549/DDP細(xì)胞與不加CIK的A549/DDP細(xì)胞相比，DDP對前者的抑制作用更強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以DDP對細(xì)胞的抑制率和順鉑濃度的對數(shù)值進(jìn)行線性回歸，求出DDP對A549細(xì)胞、A549/DDP細(xì)胞及加CIK干預(yù)的A549/DDP細(xì)胞的IC50值分別為3.980、9.518、2.399 μg/mL，進(jìn)一步計(jì)算出RI(耐藥指數(shù))=2.391，RF(逆轉(zhuǎn)倍數(shù))=3.967。

分組順鉑濃度(μg/mL)0.512481632A549+順鉑0.205±0.0160.319±0.0140.368±0.0070.539±0.0090.594±0.0110.668±0.0060.811±0.008A549/DDP+順鉑0.139±0.0230.193±0.0150.273±0.0190.320±0.0170.426±0.0200.595±0.0060.698±0.005A549/DDP+CIK+順鉑0.284±0.0200.376±0.0270.509±0.0050.581±0.0190.638±0.0080.726±0.0110.846±0.004

2.3 Real time PCR檢測A549細(xì)胞、A549/DDP細(xì)胞以及CIK干預(yù)后的A549/DDP細(xì)胞中ERCC1 mRNA的表達(dá)情況 不同細(xì)胞中ERCC1 mRNA相對表達(dá)量(見表4)。A549細(xì)胞與A549/DDP細(xì)胞相比ERCC1 mRNA相對表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CIK干預(yù)組A549/DDP細(xì)胞與未加CIK的A549/DDP細(xì)胞相比，ERCC1 mRNA表達(dá)量稍降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

組別ERCC1 mRNA 相對表達(dá)量A549細(xì)胞 0.420±0.120*A549/DDP細(xì)胞3.744±0.728A549/DDP細(xì)胞+CIK3.497±0.357**

注：*與A549/DDP細(xì)胞組相比，P<0.05；**與A549/DDP細(xì)胞組相比，P>0.05。

2.4 Western blot檢測各組細(xì)胞中ERCC1蛋白表達(dá)情況 以β-actin為內(nèi)參，采用Western blot方法測得ERCC1蛋白相對表達(dá)量(見表5)。ERCC1蛋白在A549細(xì)胞組中表達(dá)較A549/DDP細(xì)胞組明顯降低(P<0.05)。未加CIK的A549/DDP細(xì)胞組與CIK干預(yù)后的A549/DDP細(xì)胞組比較，ERCC1蛋白表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)。

注：A：A549/DDP細(xì)胞+CIK組；B：A549/DDP細(xì)胞組；C：A549細(xì)胞組。 圖1 ERCC1蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)水平

組別ERCC1 蛋白相對表達(dá)量A549細(xì)胞0.0076±0.0006*A549/DDP細(xì)胞0.0231±0.0011A549/DDP細(xì)胞+CIK0.0220±0.0007**

注：*與A549/DDP細(xì)胞組相比，P<0.05；**與A549/DDP細(xì)胞組相比，P>0.05。

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤首位，其就診時(shí)多屬中晚期，化療是其主要的治療手段，但化療對肺癌的療效已達(dá)到一個(gè)瓶頸，其主要原因是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥所致。因此，研究腫瘤產(chǎn)生耐藥機(jī)制，尋找有效的逆轉(zhuǎn)方法以提高化療的有效率成為當(dāng)前國內(nèi)外腫瘤界研究的熱點(diǎn)。

近年來，許多藥物和物理方法被發(fā)現(xiàn)能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，但因副作用大、存在技術(shù)困難等因素而不能在臨床中得到推廣應(yīng)用。CIK細(xì)胞因其廣譜的殺瘤活性以及對機(jī)體不良反應(yīng)小而倍受關(guān)注。已有研究報(bào)道，CIK能逆轉(zhuǎn)腫瘤對化療藥物的耐藥性。CIK細(xì)胞又稱自然殺傷樣T淋巴細(xì)胞，具有NK細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合體限制性殺瘤特點(diǎn)和T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性，其主要效應(yīng)細(xì)胞是CD3+CD56+T細(xì)胞。除了直接殺傷腫瘤細(xì)胞外，CIK細(xì)胞還可分泌大量細(xì)胞因子，通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)間接殺傷腫瘤細(xì)胞。CIK治療安全性好，不良反應(yīng)少，且能改善患者一般情況[2]。劉鵬英等[3]研究發(fā)現(xiàn)，CIK細(xì)胞聯(lián)合多西紫杉醇可抑制SPC-A1/DTX細(xì)胞的生長，增強(qiáng)化療療效。鄧琦等[4]通過CIK與ADR對K562/ADR先后作用，測得腫瘤細(xì)胞內(nèi)P-gp表達(dá)降低，K562/ADR對ADR的敏感性增加。本實(shí)驗(yàn)表明， A549/DDP細(xì)胞與人肺腺癌A549細(xì)胞相比，對DDP耐藥，RI=2.391。經(jīng)CIK預(yù)處理后的A549/DDP細(xì)胞對DDP的敏感性增加，RF=3.967。本結(jié)果與以往的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了CIK可能是一種理想的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑。

通常，一種腫瘤細(xì)胞的耐藥有多種耐藥機(jī)制參與，CIK有可能通過多種機(jī)制完成對耐藥的逆轉(zhuǎn)。熊艷娟等[5]已證實(shí)CIK細(xì)胞通過分泌IFN-γ下調(diào)A549/DDP細(xì)胞中GST-γ逆轉(zhuǎn)DDP耐藥的作用。蔣東霞等[6]發(fā)現(xiàn)CIK能使P-gP、mdr-l表達(dá)下調(diào)，逆轉(zhuǎn)耐藥。現(xiàn)有的報(bào)道多從藥物外排增加和細(xì)胞解毒系統(tǒng)功能增強(qiáng)兩條途徑來研究，針對CIK是否通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)途徑來逆轉(zhuǎn)耐藥，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從DNA修復(fù)途徑來探討CIK逆轉(zhuǎn)耐藥的可能機(jī)制，ERCC1作為參與DNA修復(fù)的關(guān)鍵基因，目前已有很多研究報(bào)道ERCC1的表達(dá)與鉑類化療敏感性相關(guān)。

ERCC1是一種高度保守的 DNA 核酸內(nèi)切酶，在清除鉑-DNA加合物以及修復(fù)DNA雙鏈斷裂中扮演了重要的角色。鄭玲等[7]報(bào)道，ERCC1陽性表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者對鉑類耐藥。有學(xué)者通過各種途徑封閉、干擾、降低或沉默腫瘤細(xì)胞中ERCC1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對鉑類敏感性增加。

綜上所述，ERCC1的表達(dá)與腫瘤耐藥有關(guān)。本研究中Real-Time RT-PCR/Western Blot結(jié)果顯示，ERCC1 mRNA和蛋白在A549/DDP細(xì)胞中的相對表達(dá)量明顯高于A549細(xì)胞(P<0.05)，與夏瑩等[8]的報(bào)道一致，推測ERCC1可能參與了耐順鉑人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞耐藥機(jī)制的形成。然而，本研究發(fā)現(xiàn)CIK預(yù)處理和未加CIK處理組的A549/DDP細(xì)胞相比，殺瘤率增加而ERCC1 mRNA和蛋白的表達(dá)無明顯差異，提示ERCC1可能不是CIK細(xì)胞逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞耐藥的靶基因。CIK細(xì)胞的加入使A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性增加，亦有可能CIK與順鉑之間存在協(xié)同作用，已有研究證實(shí)順鉑能提高A549細(xì)胞NKG2D配體的表達(dá)，增強(qiáng)A549細(xì)胞對CIK細(xì)胞殺傷的敏感性[9]，順鉑對A549/DDP細(xì)胞是否也具有同樣作用，有待進(jìn)一步研究。

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