大黃素聯(lián)合3′-疊氮-3′-脫氧胸腺核苷對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用

原凌燕,陳 徹,劉 玉,楚慧媛

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

大黃素(Emodin)是從大黃屬、鼠李屬、蓼屬植物和番瀉葉等中分離出來(lái)的主要成分，其化學(xué)名為1，3，8-三羥基-6甲基蒽醌，具有抗菌消炎、抗腫瘤、免疫抑制、保肝、促進(jìn)胃腸平滑肌運(yùn)動(dòng)等作用[1-2]，由于許多腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥已不敏感而對(duì)大黃素還存在一定的敏感度，這就為抗腫瘤治療提供了新的前景 。但體外研究也顯示較大劑量的大黃素能導(dǎo)致近曲小管的損傷，具有潛在的腎臟毒性。篩選適當(dāng)抗腫瘤藥物與大黃素聯(lián)合是腫瘤治療的策略之一。

3′-疊氮-3′-脫氧胸腺核苷(Azidothymidine，AZT)是一種端粒酶抑制劑，為胸苷類似物，是重要的艾滋病治療藥物。近年來(lái)，由于具有對(duì)端粒酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，AZT針對(duì)腫瘤的研究也引起了研究人員的廣泛關(guān)注。實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示AZT對(duì)多種腫瘤具有良好的抑制作用[3-5]，但由于治療時(shí)所需劑量較大，由此產(chǎn)生的毒副作用也嚴(yán)重限制了AZT在臨床抗腫瘤領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。近期的研究發(fā)現(xiàn)，AZT是較為突出的抗腫瘤協(xié)同劑，在安全劑量范圍與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)實(shí)體腫瘤具有明顯的協(xié)同治療作用[6]。

通過(guò)聯(lián)合用藥達(dá)到增效減毒目的是腫瘤研究中極富研究?jī)r(jià)值的課題。大黃素和AZT聯(lián)合用藥是否在人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡方面存在協(xié)同作用，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究旨在觀察大黃素聯(lián)合AZT對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用和對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步探討大黃素和AZT的臨床抗腫瘤應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞株HepG2，由甘肅中醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和藥品 大黃素(純度大于98%)購(gòu)于甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司， AZT、MTT、DMSO均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司， DMEM購(gòu)自美國(guó)GibcoBRL公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司， Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MTT比色法觀察對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 大黃素用DMSO溶解(DMSO終濃度<0.1%)，AZT在PBS溶解后用DMEM稀釋到所需濃度。大黃素終濃度依次為1、2、4、8和16μmol/L，AZT終濃度依次為2.5、5、10、20和40 μmol/L。

MTT照以下步驟進(jìn)行：培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL, 在96孔板中, 每孔加90 μL細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)設(shè)藥物實(shí)驗(yàn)組(大黃素單用組、AZT單用組、大黃素/AZT聯(lián)合用藥組)和對(duì)照組。5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，藥物實(shí)驗(yàn)組每孔依次加入10 μL上述所需濃度藥液，使大黃素單用組大黃素終濃度依次為1、2、4、8和16 μmol/L；AZT單用組AZT終濃度依次為2.5、5、10、20和40 μmol/L；大黃素/AZT聯(lián)合用藥組大黃素/AZT終濃度依次為1/2.5、2/5、4/10、8/20和16/40 μmol/L。對(duì)照組加等量的DMEM培養(yǎng)液，每種劑量設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，分別培養(yǎng)24、48、72 h后, 加入5 mg/mL的MTT 5 μL，作用4 h，吸去培養(yǎng)液, 加入100 μL DMSO,置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，全自動(dòng)酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度值(OD值)， 按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)，并以每個(gè)實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，單藥組與聯(lián)合用藥組分別比較。

IR(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100% 。

1.3.2 藥物協(xié)同作用分析 CalcuSyn2.0軟件(Biosoft,USA) 計(jì)算不同濃度的大黃素和AZT以固定比例組合(大黃素濃度∶AZT濃度=1∶2.5)的藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)和聯(lián)合用藥指數(shù)(combination index，CI)。CI<1表示協(xié)同， CI>1表示拮抗，CI=1表示相加。

1.3.3 Annexin V /PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取指數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，在6孔板中，每孔加2.0 mL細(xì)胞懸液。5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后，藥物試驗(yàn)組每孔分別加入大黃素：終濃度為4 μmol/L；AZT：終濃度10 μmol/L；大黃素+AZT：終濃度4 μmol/L大黃素+10 μmol/L AZT，對(duì)照組加等量的DMEM培養(yǎng)液，(加藥時(shí)72 h組先加藥，48 h組后加藥，24 h后3個(gè)時(shí)間段的細(xì)胞可同時(shí)收集)。實(shí)驗(yàn)設(shè)藥物實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。對(duì)照組加等量的DMEM培養(yǎng)液，按照每孔5×105個(gè)細(xì)胞鋪6孔板，貼壁過(guò)夜后每孔加入2.0 mL培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72 h后離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，按試劑盒說(shuō)明重懸細(xì)胞，分別加入5 μL 的Annexin V-FITC和PI，4 ℃避光30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 大黃素、AZT及聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度大黃素、AZT以及相應(yīng)濃度的聯(lián)合用藥作用于HepG2細(xì)胞24、48、72 h后對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞膜清晰，細(xì)胞核完整，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密；給藥組中，細(xì)胞的增殖緩慢并呈現(xiàn)不同程度的損傷，細(xì)胞逐漸變圓，附壁疏松，脫壁，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞周圍碎片增多，聯(lián)合給藥組細(xì)胞損傷表現(xiàn)較單藥組更明顯。大黃素、AZT及其聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果如圖1所示，單藥給藥組中，隨大黃素和AZT濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng)，呈劑量依賴性；隨時(shí)間的延長(zhǎng)，大黃素和AZT對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)，呈時(shí)間依賴性。大黃素和AZT聯(lián)合作用HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果顯示，隨合用藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用顯著增強(qiáng)，呈時(shí)間和濃度依賴性。系列濃度的大黃素和AZT聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞24、48、72 h，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率分別與相應(yīng)濃度的AZT或大黃素單用作用HepG2細(xì)胞相同時(shí)間相比，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(除大黃素/AZT 1.0/2.5 μM作用24 h，P<0.05外，其他濃度時(shí)間情況P<0.01)。

注：以系列濃度的大黃素、AZT及其聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞24、48、72 h，對(duì)由MTT法得到的聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率分別與大黃素或AZT單用加以比較，a:P<0.05, b: P<0.01。圖1 大黃素、AZT及其聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 大黃素和AZT作用HepG2細(xì)胞的聯(lián)合作用指數(shù)(CI) 固定比率的大黃素和AZT聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞24、48、72 h的IR和由此通過(guò)CalcuSyn 2.0軟件計(jì)算所得的不同濃度和作用時(shí)間大黃素和AZT的聯(lián)合作用指數(shù)(見(jiàn)表1)，CI值均小于1，表明大黃素和AZT聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2在3個(gè)作用時(shí)間和所考察的藥物濃度的聯(lián)合用藥都表現(xiàn)為協(xié)同作用，而且在作用時(shí)間達(dá)到48 h以后，CI值均小于0.4，提示大黃素和AZT的聯(lián)合隨著作用HepG2細(xì)胞時(shí)間的增加，增殖抑制的協(xié)同效應(yīng)逐漸加強(qiáng)。

2.3 大黃素和AZT及聯(lián)合應(yīng)用的劑量-抑制效應(yīng) 利用試驗(yàn)所檢測(cè)的濃度和IR數(shù)據(jù)，經(jīng)由CalcuSyn 2.0軟件推算和模擬出了大黃素和AZT以固定濃度比率(1∶2.5)作用HepG2細(xì)胞的劑量-抑制效應(yīng)，表2展示了大黃素、AZT及其聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃素或AZT單藥作用HepG2細(xì)胞后24、48、72 h時(shí)，大黃素和AZT的 IC50分別遠(yuǎn)高于試驗(yàn)中所用最高濃度16、40 μmol/L；聯(lián)合用藥使大黃素和AZT 對(duì)HepG2細(xì)胞達(dá)到一定增殖抑制效果所需的濃度顯著下降，聯(lián)合作用72h的IC50為2.34 /5.86 μmol/L。

表1大黃素和AZT聯(lián)合作用HepG2細(xì)胞不同時(shí)間的IR及聯(lián)合作用指數(shù)

時(shí)間(h)大黃素/μmol·L-1AZT/μmol·L-1IRCI12.50.03040.71725.00.0570.573244100.08560.6218200.13690.59416400.19390.66412.50.17360.15725.00.24640.148484100.29850.1898200.35370.24616400.40040.35112.50.35970.10425.00.48170.100724100.59330.1048200.67010.12916400.79280.103

表2大黃素、AZT及其聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度

實(shí)驗(yàn)藥物IC50 /μmol·-124h48h72h大黃素398.70312.15216.48AZT794.91316.8261.67大黃素+AZT105.68/264.2137.02/92.54072.34/5.86

2.4 Annexin V /PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，各組藥物作用HepG2細(xì)胞24 h后，大黃素、AZT和二者聯(lián)合給藥組細(xì)胞凋亡率分別為1.87%、9.59%、23.10%，對(duì)照組正常生長(zhǎng)的HepG2細(xì)胞僅為0.26%；隨著作用時(shí)間增加，調(diào)亡率逐漸升高， 48h對(duì)照組、單藥大黃素、單藥AZT和聯(lián)用藥物組凋亡率分別為0.68%、3.43%、25.02%、40.43%；到72 h上述4組凋亡率差異更為明顯，聯(lián)合用藥的凋亡率達(dá)到51.86%。圖2所示為各組藥物作用HepG2細(xì)胞72 h的凋亡比率。結(jié)果表明，大黃素與AZT聯(lián)用較大黃素或AZT單用均有更顯著的促凋亡作用。

圖2 藥物作用HepG2細(xì)胞72 h 的凋亡比率

3 討論

在肝癌的藥物治療中，細(xì)胞毒性藥物的作用有限，這也是肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥的難點(diǎn)所在[7]。由于中藥具有通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用及不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)勢(shì)，中藥抗腫瘤的有效成分及作用機(jī)理研究已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[8-9]。另外，根據(jù)抗腫瘤藥不同的作用機(jī)制和腫瘤細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)進(jìn)行合理聯(lián)合用藥，使其增效減毒及避免耐藥是目前腫瘤治療研究中的重要進(jìn)展之一。而應(yīng)用端粒酶抑制劑聯(lián)合小分子中藥單體成分如蒽醌類、喹啉類和小檗堿及其類似物等已經(jīng)成為近年來(lái)抗腫瘤藥物研究的重要方向之一。本研究考察了大黃素與AZT對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示，大黃素或AZT單用對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用均呈現(xiàn)明顯的藥物濃度和藥物作用時(shí)間依賴性，兩種藥物聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用明顯優(yōu)于單獨(dú)給藥, 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果也表明，大黃素與AZT聯(lián)用較大黃素或AZT單用均有更顯著的促凋亡作用，說(shuō)明大黃素聯(lián)合AZT對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)存在協(xié)同效應(yīng)。

大黃素作為具有化療輔助作用的中藥單體成分，能抑制胰腺癌、前列腺癌、大腸癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。同時(shí)，大黃素能顯著增強(qiáng)三氧化二砷[10]、5-氟尿嘧啶[11]、鉑類[12]、紫杉醇[13]、吉西他濱[14]和姜黃素[15]等藥物在多種腫瘤細(xì)胞中的藥物敏感性，發(fā)揮協(xié)同作用。在我們研究的濃度范圍，大黃素單獨(dú)給藥對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用均較單用AZT弱，但大黃素與AZT聯(lián)合后，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖卻表現(xiàn)出明顯的協(xié)同抑制作用，通過(guò)Calcusyn2.0軟件計(jì)算的兩藥協(xié)同作用指數(shù)，在所研究的藥物濃度和作用時(shí)間均小于1，表明兩藥有較好的協(xié)同作用；而且藥物協(xié)同作用隨作用時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)得更為顯著，48和72 h均表現(xiàn)為強(qiáng)協(xié)同作用(0.6≤CI≤ 0.8為中度協(xié)同作用，0.4≤CI≤0.6為高度協(xié)同作用，0.2≤CI≤0.4為強(qiáng)協(xié)同作用)。研究中所發(fā)現(xiàn)的協(xié)同效應(yīng)與有關(guān)的研究結(jié)果相似[16-18]。

該研究證明了體外大黃素和AZT聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)HepG2的增殖抑制具有協(xié)同作用，與單獨(dú)用藥相比，聯(lián)合用藥時(shí)較低劑量就可以產(chǎn)生單用較大劑量藥物時(shí)的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)效果，提示這兩種藥物可能作用于HepG2細(xì)胞不同增殖階段或靶點(diǎn)而發(fā)揮增殖抑制作用。研究結(jié)果表明這兩種藥物的較低濃度的聯(lián)合即具有減少毒副作用并顯著提高治療效果的雙重作用，結(jié)果支持在HepG2的治療研究和應(yīng)用中，可選用低而無(wú)毒副作用的大黃素和AZT劑量(最高劑量均未達(dá)到IC50)的聯(lián)合方案。通過(guò)大黃素聯(lián)合端粒酶抑制劑治療肝癌，借助聯(lián)合用藥的協(xié)同效應(yīng)，則可以通過(guò)適當(dāng)增加藥物的劑量以增強(qiáng)療效而將毒性反應(yīng)控制在可以接受的范圍之內(nèi)，或在維持原療效水平的同時(shí)減低毒性藥物的用量。因此，大黃素與AZT聯(lián)合應(yīng)用于肝癌的治療可能是一種相對(duì)比較安全的用藥方案，本研究為探索新的肝癌治療方法提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。兩藥聯(lián)合抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的機(jī)制還有待研究，而且體外細(xì)胞研究的結(jié)果尚需通過(guò)進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Hazni H, Ahmad N, Hitotsuyanagi Y, et al. Phytochemical constituents from Cassia alata with inhibition against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) [J]. Planta Medica, 2008, 74(15): 1802-1805.

[2] 喻安永，潘勇，羅云霞，等. 大黃對(duì)多發(fā)傷兔急性肺損傷模型的保護(hù)作用[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 36(4): 294-297.

[3] 靳蕊蕊, 晁榮, 席亞明, 等. AZT 對(duì)白血病細(xì)胞株 KG-1a 細(xì)胞增殖和端粒酶活性的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2012,20 (2): 277-281.

[4] 何敏, 蔣玉艷, 朱淼, 等. AZT 對(duì)肝癌細(xì)胞端粒酶活性及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J]. 癌癥, 2006, 25(5): 543-548.

[5] 王偉, 劉俊平. 端粒酶與腫瘤[J]. 世界華人消化雜志, 2002, 10(6): 683-688.

[6] Sun Y, Guo T, Xi Y, et al. Effects of AZT and RNA-protein complex (FA-2-b-beta) extracted from Liang Jin mushroom on apoptosis of gastric cancer cells [J]. World J Gastroentero,2007,13(31):4185-4191.

[7] 孫越鵬，耿磊，李長(zhǎng)福，等. SiRNA沉默HBx表達(dá)對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 36(4): 301-305.

[8] 郭辰睿，李寧. 康艾注射液聯(lián)合培美曲塞二線治療非鱗狀非小細(xì)胞肺癌54例療效觀察[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 36(6): 568-570.

[9] 鄒品文，趙春景，李攀，等. 黃芪多糖抗S180肉瘤作用及其免疫調(diào)節(jié)的影響[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 35(1): 17-20.

[10] Yang J, Li H, Chen Y, et al. Anthraquinones sensitize tumor cells to arsenic cytotoxicity in vitro and in vivo via reactive oxygen species-mediated dual regulation of apoptosis.[J]. Free Radic Biol Med, 2004, 37(12): 2027-2041.

[11] 尚闖, 龐志剛, 劉超, 等. 大黃素與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J]. 河南外科學(xué)雜志, 2012, 18(3): 78-78.

[12] Wang W, Sun Y, Huang X, et al. Emodin enhances sensitivity of gallbladder cancer cells to platinum drugs via glutathion depletion and MRP1 downregulation [J]. Biochem Pharmacol,2010, 79(8): 1134-1140.

[13] Li J, Liu P, Mao H, et al. Emodin sensitizes paclitaxel-resistant human ovarian cancer cells to paclitaxel-induced apoptosisinvitro[J]. Oncol Rep,2009,21(6):1605-1610.

[14] 曾勇, 劉岸, 童洪飛, 等. 大黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)體外人胰腺癌細(xì)胞株 BxPC-3 生長(zhǎng)及凋亡的影響[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2011, 31(4): 552-554.

[15] 雷湘，李娟，陳科力，等．大黃素與姜黃素聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7402生長(zhǎng)抑制的協(xié)同作用[J]．中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009， 29(12)： 971-973．

[16] 方麗, 周進(jìn). 大黃素與順鉑聯(lián)用抗人肝癌細(xì)胞株 HepG2 增殖和凋亡的研究[J]. 四川醫(yī)學(xué), 2008, 29(8): 963-964.

[17] 劉劍波, 高學(xué)崗, 連濤, 等. 大黃素在體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞 HepG2 發(fā)生凋亡的初步研究[J]. 癌癥: 英文版, 2003, 22(12): 1280-1283.

[18] Chen C, Zhang Y, Wang Y, et al. Synergistic effect of 3’-Azido-3’-deoxythymidine and As2O3on human hepatoma cell lines HepG2 [J]. Anti-Cancer Drugs, 2011, 22(5): 435-441.