缺血后處理對大鼠腦缺血/再灌注損傷內質網應激通路相關分子的影響

劉 楠， 于雪凡， 李 巖， 牛振華

腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion)損傷是急性腦梗死血栓再通后的一種常見的病理生理現象，可以引起一系列級聯(lián)反應，包括鈣離子穩(wěn)態(tài)破壞、興奮性毒性氨基酸產生、氧化應激、線粒體功能障礙等，最終導致細胞壞死或凋亡。研究證明，內質網應激在腦缺血/再灌注損傷導致的神經細胞凋亡中發(fā)揮重要作用［1］。缺血后處理(ischemic postconditioning)是指在再灌注早期，重復給予幾次短暫的的非致死性的血管閉塞與再通的過程［2］，被認為是一種缺血/缺氧耐受現象。缺血后處理腦保護作用逐漸為人們所認識，但其機制尚不完全清楚。Hayashi等人的研究發(fā)現，腦缺血預處理可以激活適當的內質網應激，增強內質網處理未折疊蛋白反應(UPR)的能力，促進內質網功能的恢復，延緩和減輕缺血/再灌注造成的組織損傷［3］。缺血后處理是否也可以通過減弱內質網應激(ERS)從而發(fā)揮神經保護作用，目前國內外研究較少［4］。本研究從ERS角度探討缺血后處理在大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷中的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組和模型制備 動物分組:清潔級健康成年雄性Wistar大鼠58只，體重240～280 g，由吉林大學白求恩基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為假手術組(sham組 n=6)、缺血/再灌注組(I/R組n=26)和缺血后處理組(IP組n=26)。后兩組依據再灌注時間不同再分為6 h、12 h、24 h 3個亞組。

改良Longa［5］線栓法制備左側大腦中動脈阻塞(MCAO)模型:大鼠用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸部正中切口，延左側胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜，分離頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)并掛線備用，結扎CCA和ECA，在頸外動脈剪一小口，將制備好的線栓插入ECA經CCA分叉處進入ICA，通過大腦中動脈起始端至大腦前動脈近端(插入深度平均約18.5±0.5 mm)，直至稍感阻力，扎緊備線，固定線栓。缺血2 h后拔出線栓實施再灌注6 h、12 h、24 h。假手術組僅暴露CCA、ECA及ICA，不做插線處理。缺血后處理組實施方法為缺血2h后將線栓拔至 CCA分叉處，實現再灌 10 min，后再次行MCAO 10 min，隨后分別實現再灌注 6 h、12 h、24 h。所有實驗動物均術前禁食12 h，不禁水，術中及術后維持肛溫在37℃，術后單籠飼養(yǎng)。

1.2 神經行為學評分 腦缺血2 h再灌注24 h，由不知分組情況的觀察者根據Zea Longa 6級5分制評分法［5］對大鼠進行評分。評分標準:0分:無神經損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側前爪;2分:向對側轉圈;3分:向對側傾倒;4分:不能自發(fā)行走，意識喪失;5分:死亡。其中評分為1～3分且無蛛網膜下腔出血的大鼠納入分組，0分、4分和5分剔除，并隨機補充。

1.3 腦梗死體積測定 腦缺血2 h再灌注24 h后，將大鼠麻醉，迅速斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，于-20℃冰箱中速凍15 min，沿著冠狀切面切成6片，每片厚度約2 mm，將腦片放入2%TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)溶液中，37 ℃避光染色30 min，正常腦組織染成紅色，梗死灶成白色。將腦片置于4%多聚甲醛溶液固定4～6 h后，數碼相機拍照，應用Image J圖像分析軟件計算腦片梗死面積。根據公式V=(A1+～+An)t算出梗死體積，其中t為切片厚度，A為梗死面積。結果以梗死體積占缺血側總體積的百分比表示。梗死體積百分比(%)=梗死體積/缺血側總體積×100%［6］。

1.4 免疫組化標本取材與制備 大鼠經10%水合氯醛腹腔麻醉，打開胸腔，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛行心臟灌流，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中固定24 h。于視交叉后1.7～4.0 mm冠狀切片，取中間切塊逐級脫水、透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋制作石蠟標本，保存于4℃冰箱中備用。

1.5 免疫組化檢測GRP78、caspase-12蛋白表達 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司(PV-6000)，嚴格按照說明書進行操作。一抗(Abcam公司)工作濃度1∶50。DAB顯色后蘇木素輕度復染。常規(guī)封片，鏡下進行定性觀察(圖1A箭頭所示為觀察部位)。判斷標準:鏡下胞質或胞核有棕黃色顆粒者為陽性細胞。在10×40倍光鏡下每張切片隨機選5個不重復視野進行拍照，應用Image pro plus圖像分析軟件計數各指標的陽性細胞數。陽性細胞率(%)=陽性細胞數/總細胞數×100%。

2 結果

2.1 大鼠神經行為學評分比較 假手術組無神經系統(tǒng)損害，評分為0;后處理組神經缺損程度明顯減輕，低于缺血/再灌注組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.304，P=0.000)(見圖1B)。

2.2 腦梗死體積百分比的比較 假手術組腦組織呈均勻紅色，無梗死灶;與缺血/再灌注組相比，后處理組梗死體積減小，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.559，P=0.000)(見圖1C、圖 1D)。

2.3 免疫組化檢測GRP78、caspase-12蛋白表達 Sham組缺血半暗帶GRP78、caspase-12陽性細胞僅少量表達。與sham組相比，I/R組再灌注后6 h、12 h、24 h GRP78、caspase-12 陽性細胞數量明顯增加，GRP78于再灌注后12 h達高峰，caspase-12于再灌注后24 h達高峰，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與 I/R 組相比，Ipost組再灌注 12 h、24 h GRP78陽性細胞數量明顯增加(見圖2)，再灌注后24 h caspase-12陽性細胞數量明顯減少(見圖3)，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見表1、表2)。

表1 腦組織缺血半暗帶內GRP78蛋白陽性細胞率的比較(，n=6)

表1 腦組織缺血半暗帶內GRP78蛋白陽性細胞率的比較(，n=6)

與假手術組相比*P＜0.05;與缺血再灌注組相比#P＜0.05

組別 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術組腦缺血/再灌注組腦缺血后處理組40.17 ±5.04*47.83 ±7.52 55.33 ±8.71*66.17 ±7.31#6.50 ±2.74 45.00 ±9.84*61.17 ±13.11#

表2 腦組織缺血半暗帶內caspase-12蛋白陽性細胞率的比較(，n=6)

表2 腦組織缺血半暗帶內caspase-12蛋白陽性細胞率的比較(，n=6)

與假手術組相比*P＜0.05;與缺血再灌注組相比#P＜0.05

組別 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術組腦缺血/再灌注組腦缺血后處理組26.00 ±7.56*23.33 ±6.86 33.83 ±5.67*26.83 ±7.52 7.17 ±3.37 53.67 ±6.77*39.00 ±14.35#

圖1 大鼠腦缺血2 h再灌注24 h神經行為學評分與腦梗死體積

圖2 GRP78免疫組化染色

圖3 Caspase-12免疫組化染色

3 討論

腦缺血/再灌注損傷主要是指缺血腦組織恢復血液灌注后，腦組織損傷反而加重，導致缺血及周邊區(qū)域神經細胞壞死和凋亡。在局灶性腦缺血/再灌注損傷中，位于缺血中心區(qū)的神經細胞多發(fā)生壞死，無法再生，而缺血周邊區(qū)即半暗帶的損傷相對較輕，該區(qū)域的神經細胞多表現為凋亡。因此，挽救缺血半暗帶的神經細胞就成為腦梗死治療的重點。缺血后處理是指在再灌注早期進行短暫的、一次或多次亞致死性血管閉塞與再通［2，7］。腦缺血后處理可以減少梗死體積，抑制神經細胞凋亡，具有神經保護作用［8～10］。自缺血后處理的概念被提出后，關于其治療時間窗、再灌注/缺血循環(huán)次數、循環(huán)時程、潛在的保護機制等，仍無統(tǒng)一定論。本研究采用Pignataro等［8］的再灌注10 min/缺血10 min的后處理操作，結果顯示缺血后處理組腦梗死體積較缺血/再灌注組明顯減低，且神經功能缺損程度明顯改善，可見此后處理方法對大鼠腦缺血/再灌注損傷有保護作用。

內質網是真核細胞中重要的細胞器，它由封閉的膜系統(tǒng)及其圍成的腔形成互相溝通的網狀結構，對細胞正常功能的維持至關重要［11］。內質網在調節(jié)膜蛋白、分泌蛋白的折疊與加工、鈣的儲存與釋放方面具有重要的作用［12］。研究表明，腦缺血/再灌注可以引起內質網固有蛋白折疊或加工過程受阻、鈣離子穩(wěn)態(tài)被打破，導致內質網功能障礙，從而觸發(fā)ERS［1］。目前認為，ERS介導的神經細胞凋亡在缺血性腦卒中病理生理學機制中發(fā)揮重要作用［12，13］。GRP78屬于熱休克蛋白70(HSP70)家族一員［14］，同時也是內質網重要的分子伴侶［15］。生理狀態(tài)下，GRP78分別與 PERK、IRE1α、ATF6(感受內質網應激信號的3種跨膜蛋白)暴露于ER腔中的結構域結合，處于非活化狀態(tài)。內質網功能障礙時，未折疊蛋白大量聚集，GRP78便與 PERK、IRE1α、ATF6解離，轉而與未折疊蛋白結合，由此促進蛋白質的正確折疊。ERS是細胞的一種自我保護機制，以恢復內質網內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，但是嚴重且持續(xù)時間較長的ERS將最終導致神經細胞凋亡。Caspase-12定位于ER外膜，是介導ERS凋亡的關鍵分子，在死亡受體或線粒體凋亡途徑中不被活化。Caspase-12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡而其他死亡刺激仍可誘導其發(fā)生凋亡，表明caspase-12與ERS介導凋亡的機制有關，而與非ERS介導的凋亡無關［16］。生理情況下，caspase-12以無活性的酶原形式存在，ERS狀態(tài)下，caspase-12酶原特異性激活，進而激活下游caspase-9、caspase-3 級聯(lián)反應，介導細胞凋亡［17］。

本研究結果顯示，腦缺血2 h再灌注6 h缺血半暗帶GRP78、caspase-12蛋白表達開始增加，GRP78于再灌注后12 h達高峰，caspase-12于再灌注后24 h達高峰，與 Shibata等［18］的報道一致。與缺血再灌注組相比，缺血后處理組再灌注后12 h、24 h GRP78蛋白表達明顯增加，再灌注后24 h caspase-12蛋白表達明顯減少。上述發(fā)現說明，腦缺血/再灌注損傷啟動了內質網應激反應，誘導了GRP78和caspase-12的表達。缺血后處理組上調了內質網應激蛋白GRP78的表達，減弱了caspase-12的表達。因此缺血后處理可以通過減弱內質網應激從而發(fā)揮神經保護作用，抑制神經細胞凋亡。

綜上所述，缺血后處理可明顯改善大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷所致的神經功能缺損癥狀，并減少腦梗死體積，具有神經保護作用。其機制可能與上調GRP78的表達、抑制caspase-12的表達相關。說明腦缺血后處理可能通過減弱內質網應激過程從而對隨后發(fā)生的再灌注損傷起到了神經保護作用。

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