沒食子酸抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用研究

郗艷麗，張洋婷，馬洪波，劉 敏，武祥群，牛鳳蘭*,王舒然*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長春 吉林 130021)

·論 著·

沒食子酸抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用研究

郗艷麗1,2，張洋婷1，馬洪波1，劉 敏1，武祥群2，牛鳳蘭2*,王舒然1*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長春 吉林 130021)

目的 探討沒食子酸對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖的抑制作用。方法 MTT比色法檢測沒食子酸對HUVECs增殖的抑制作用；用AO/EB熒光雙染色法檢測細(xì)胞凋亡和壞死；激光共聚焦顯微鏡檢測沒食子酸對F-actin和細(xì)胞核的影響。結(jié)果 濃度為40、60、80和100 μg/mL的沒食子酸明顯抑制了HUVECs細(xì)胞增殖，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；熒光雙染色法結(jié)果顯示沒食子酸誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生凋亡和壞死，且隨沒食子酸濃度的增加，死亡細(xì)胞的比例顯著增多；熒光染色顯示細(xì)胞骨架蛋白F-actin的細(xì)絲發(fā)生斷裂或重排，細(xì)胞核發(fā)生邊集。結(jié)論 沒食子酸具有顯著抑制HUVECs增殖，誘導(dǎo)其凋亡和壞死的作用；此外，沒食子酸還能破壞細(xì)胞骨架蛋白F-actin,這與抑制細(xì)胞遷移密切相關(guān)。

沒食子酸 ；血管內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

沒食子酸(Gallic acid)，化學(xué)名3,4,5-三羥基苯甲酸(3,4,5-Trihydroxy benzoic acid)，是一種資源豐富的多酚類化合物，廣泛存在于茶葉、葡萄漿果類水果、紅酒、橡樹、栗子等植物中[1]。研究證實(shí)，沒食子酸對宮頸癌[2]、乳腺癌[3]、肺癌[4]、前列腺癌[5]等多種腫瘤都有很好的抑制作用，此外，沒食子酸對正常細(xì)胞的毒性比較低[6-7]，因此被認(rèn)為是一類理想的低毒高效的抗腫瘤化合物。沒食子酸在抗腫瘤方面的作用備受關(guān)注[8-9]，但是對于腫瘤血管的影響一直少有報道。血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移是腫瘤血管生成的必要條件。抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移是控制腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[10]。本研究旨在探討沒食子酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Tecan infinite M200 型多功能酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司)，Olympus XSP-63XD激光共聚焦顯微鏡(日本奧林帕斯公司)。沒食子酸，噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，吖啶橙(acridine orange，AO)，溴化乙錠(ethidium bromide，EB),羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，4′6-二脒基-2-苯基吲哚(4′6- diamidino-2-phenylindole，DAPI)，DMEM高糖培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)，胎牛血清，胰蛋白酶和青霉素/鏈霉素溶液(購于Sigma公司)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶，激光共聚焦培養(yǎng)皿，96孔培養(yǎng)板和巴氏消毒管(購于BD公司)。二甲基亞砜(DMSO)為分析純。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)(購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.2 HUVECs的傳代培養(yǎng)

將HUVECs復(fù)蘇后，加入全成分DMEM高糖培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，傳至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%時，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化并置于顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓后，用含血清的培養(yǎng)液終止消化。用巴氏消毒管吹打直至細(xì)胞變成單細(xì)胞懸液，移入10 mL離心管中，1 000 rpm離心5 min。吸棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液混勻后接種孔板繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 沒食子酸的制備

沒食子酸存儲液：沒食子酸粉末，用PBS配成濃度為10 mmol/L的存儲液，0.22 μm針頭式濾膜過濾分裝，4 ℃避光保存。

MTT存儲液：將MTT粉末50 mg溶于10 mL PBS中，配成濃度為5 mg/mL的存儲液，0.22 μm針頭式濾膜過濾分裝，-20 ℃避光保存。DAPI溶液：儲存液濃度為10 mg/mL,-20 ℃避光保存，用時按照1∶1 000的比例稀釋。

1.4 劑量分組

將細(xì)胞分成5個樣品組和1個對照組，樣品組沒食子酸的濃度分別為20、40、60、80和100 μmol/L。將培養(yǎng)好的細(xì)胞以1×105個/mL的濃度接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)過夜后吸棄舊培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。對照組每孔加入100 μL DMEM高糖培養(yǎng)液，藥物組每孔分別加入100 μL不同濃度的沒食子酸處理24 h后終止培養(yǎng)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 MTT比色法

沒食子酸處理24 h 后，吸棄96孔板中舊的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL不含胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液，然后每孔加入MTT 儲存液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入DMSO 150 μL，37 ℃震蕩反應(yīng)10 min。置于連續(xù)光譜多功能酶標(biāo)儀中震蕩1 min，在490 nm波長處測定吸光度值(A)，并記錄結(jié)果，每個樣品設(shè)三個復(fù)孔。

1.5.2 AO/EB熒光染色法

HUVECs細(xì)胞以2.5×105個/mL的濃度接種于6孔板，每孔接種2 mL。置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞全部鋪展以后，吸棄舊培養(yǎng)液，每孔加入不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入沒食子酸，沒食子酸的終濃度分別為40、60和80 μmol/L。對照組加入不含胎牛血清的等體積培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸棄舊培養(yǎng)液，用PBS充分洗去未結(jié)合的藥物，加入AO/EB混合熒光染色液400 μL(AO的濃度為0.1 mg/mL，EB的濃度為10 μL/mL)。染色5 min中后，吸棄染色液，加入PBS洗滌2次，熒光顯微鏡下觀察并記錄。

1.5.3 F-actin的測定

細(xì)胞以2×104個/mL的濃度接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿，每皿接種2 mL。置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞完全鋪滿后吸棄舊的培養(yǎng)液，加入新鮮不含胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入不同濃度的沒食子酸處理24 h，對照組加入等體積的培養(yǎng)液。終止實(shí)驗(yàn)后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗去未結(jié)合的藥物，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2次，每孔加入濃度為50 μg/mL的羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽100 μL，室溫避光反應(yīng)30 min后，用PBS洗2次，每孔加入濃度為10 μg/mL的DAPI染色液100 μL，室溫避光孵育5 min，用PBS洗去未結(jié)合的熒光染色液，置于熒光顯微鏡下觀察并記錄。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SEM)表示，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞活力測定

不同劑量的沒食子酸作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞后，對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，結(jié)果見圖1。細(xì)胞存活率的降低與藥物劑量之間有良好的劑量反應(yīng)關(guān)系，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低。這表明隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞死亡的數(shù)量也逐漸增多。由表1可見，經(jīng)過方差分析統(tǒng)計(jì)之后發(fā)現(xiàn)，用40 μmol/L的沒食子酸處理血管內(nèi)皮細(xì)胞時，就已經(jīng)引起了明顯的細(xì)胞死亡，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。用20 μmol/L的沒食子酸處理細(xì)胞后，引起的細(xì)胞死亡與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高于40 μmol/L的沒食子酸處理組所引起的細(xì)胞死亡與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果表明，沒食子酸能有效地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

圖 1 沒食子酸對HUVECs存活率的影響

組 別n細(xì)胞存活率(μmol/L)對照組3100.00±0.0020μmol/L組377.93±6.3640μmol/L組351.90±4.68*60μmol/L組329.49±9.19*80μmol/L組322.34±1.30*100μmol/L組320.88±0.96*

*與對照組比較，P<0.05

2.2 細(xì)胞凋亡測定

AO能夠穿透完整的細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合發(fā)出綠色的熒光，而EB僅能透過受損的細(xì)胞膜并與DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光。凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)熒光染色增強(qiáng)，核染色質(zhì)呈綠色固縮狀或圓珠狀結(jié)構(gòu)，或者呈紅色正常結(jié)構(gòu)。正常細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，因此無法被染成紅色。此外，正常細(xì)胞的核染色質(zhì)呈綠色且結(jié)構(gòu)正常。通過顏色和形態(tài)可區(qū)分正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞[11]。由圖2可知，對照組經(jīng)染色后，多數(shù)細(xì)胞呈均勻的綠色熒光。核染色質(zhì)呈綠色且結(jié)構(gòu)正常，幾乎無被染成紅色的細(xì)胞，這一結(jié)果表明對照組均為活細(xì)胞。與對照組相比，40、60和80 μmol/L沒食子酸劑量組綠色熒光均有所增強(qiáng)，核染色質(zhì)有的呈固縮狀或圓珠狀。隨著劑量的增加，發(fā)生核染色質(zhì)固縮的細(xì)胞數(shù)量增多，核染色質(zhì)呈紅色且有正常結(jié)構(gòu)的細(xì)胞數(shù)量也逐漸增多。這一結(jié)果表明，隨著沒食子酸濃度的增加，發(fā)生早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。沒食子酸很有可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。在沒食子酸的高劑量組，出現(xiàn)了核染色質(zhì)為紅色并呈固縮狀或圓珠狀的細(xì)胞，這表明在高劑量組出現(xiàn)了細(xì)胞壞死的現(xiàn)象。沒食子酸在高濃度下會誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，這也可能是其抑制細(xì)胞增殖的方式。

對照組 沒食子酸(40 μmol/L)

沒食子酸(60 μmol/L) 沒食子酸(80 μmol/L)

圖 2 熒光顯微鏡觀察沒食子酸誘導(dǎo)的凋亡和壞死細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(100×)

2.3 激光共聚焦顯微鏡分析F-actin 的變化

圖3 結(jié)果表明，沒食子酸作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞以后，對照組細(xì)胞骨架蛋白F-actin 在細(xì)胞質(zhì)中分布均勻，F(xiàn)-actin被染成紅色的長條細(xì)絲清晰可見，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞核完整并且飽滿，細(xì)胞處于正常狀態(tài)。與對照組相比，沒食子酸處理組的細(xì)胞體積變小，細(xì)胞內(nèi)的F-actin的細(xì)絲發(fā)生斷裂或重排，細(xì)胞核邊集，部分細(xì)胞膜與細(xì)胞核的界限模糊。這一結(jié)果表明，沒食子酸對F-actin有明顯的破壞作用，F(xiàn)-actin的破壞會損傷細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，目前已知細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的運(yùn)動有關(guān)[12]，骨架結(jié)構(gòu)的破壞表明沒食子酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移可能也有抑制作用。細(xì)胞核的變化表明，沒食子酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡很有可能是由于核物質(zhì)的變化引起的。

對照組 沒食子酸(40 μmol/L)

沒食子酸(60 μmol/L) 沒食子酸(80 μmol/L)

圖 3 熒光顯微鏡觀察沒食子酸誘導(dǎo)的F-actin和細(xì)胞核的變化(200×)

3 結(jié) 論

眾所周知，腫瘤的生長需要新生血管為其提供充足的氧和營養(yǎng)物質(zhì)，新生血管的形成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件，并貫穿腫瘤轉(zhuǎn)移的全過程。研究表明,當(dāng)腫瘤出現(xiàn)血管化后，血管中腫瘤細(xì)胞數(shù)量與腫瘤血管密度及腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目相關(guān)[12]。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移是形成血管的必要條件。因此，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖可影響腫瘤血管的生成，從而有效地阻止腫瘤的侵襲性生長。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沒食子酸能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死的方式而實(shí)現(xiàn)的。此外，研究還發(fā)現(xiàn)沒食子酸具有抑制細(xì)胞遷移的能力。說明沒食子酸在抑制腫瘤的新血管形成 、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)中均可發(fā)揮重要作用，可以作為抗腫瘤藥物使用。如若進(jìn)一步研究，有望為沒食子酸在抗腫瘤方面的應(yīng)用提出新思路。

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Study of gallic acid inhibited cell proliferation of human umbilical vein endothelial cells

XI Yan-li1,2,ZHANG Yang-ting1,MA Hong-bo1,LIU Min1,WU Xiang-qun2*,NIU Feng-lan2,WANG Shu-ran1*

(1.Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health,Jilin Medical College,Jilin City,Jilin Province,132013;2.School of Public Health,Jilin University,Changchun city,Jilin Province,130021,China)

Objective To investigate the inhibition of cell proliferation induced by gallic acid on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods The proliferation inhibition rates of gallic acid on HUVECs were measured by MTT assay.The morphology changes of apoptotic and necrotic cells were observed by AO/EB double staining.The changes of F-actin and nucleus were detected by a laser confocal microscope. Results Gallic acid significantly inhibited the proliferation of HUVECs cells at the concentration of 40,60,80 and 100 μg/mL,compared with the control group (P<0.05).The double staining showed that gallic acid could induce the apoptosis and necrosis of HUVECs，and the ratios of death were obviously increase when the concentration of gallic acid increased.The F-actin fluorescence assay results showed that the filaments of F-actin broke or rearranged,and the nucleus edge set. Conclusion Gallic acid could inhibit the proliferation and induce apoptosis and necrosis in HUVECs cells.Furthermore,the cytoskeleton protein F-actin is destroyed by gallic acid which related to cell migration inhibition.

gallic acid;vein endothelial cells;cell growth;cell migration

1673-2995(2014)01-0001-04

郗艷麗(1981-)，女(漢族)，講師，博士.

牛鳳蘭(1951-)，女(漢族)，教授，本科.

通訊作者： 王舒然(1968-)，男(漢族)，教授，博士.

R68

A

2013-12-17)