NCTD對(duì)白血病細(xì)胞DR5表達(dá)的影響

李 妍，張 鐸，方 芳，陳 爽，趙良中

(吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

·論 著·

NCTD對(duì)白血病細(xì)胞DR5表達(dá)的影響

李 妍，張 鐸，方 芳，陳 爽，趙良中

(吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

目的 研究去甲斑蝥素(NCTD)對(duì)白血病細(xì)胞死亡受體(DR)5表達(dá)的影響。方法 不同濃度NCTD處理K562和HL-60細(xì)胞16 h后，流式細(xì)胞術(shù)分析DR5表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)相對(duì)含量；通過免疫印跡技術(shù)分析激酶JNK1的表達(dá)。結(jié)果 NCTD以濃度依賴方式上調(diào)DR5表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量和JNK1表達(dá)也隨NCTD濃度增大而增加。結(jié)論 NCTD可能通過ROS/JNK途徑上調(diào)DR5表達(dá)。

去甲斑蝥素；活性氧；腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體；死亡受體5

去甲斑蝥素(norcanthar idin,NCTD) 是斑蝥素的衍生物,臨床上用于肝癌的治療，對(duì)肺癌、乳腺癌和白血病細(xì)胞也有較強(qiáng)的抑制作用[1-2]。NCTD對(duì)骨髓抑制作用輕，近年發(fā)現(xiàn)其可通過上調(diào)死亡受體(death receptor，DR)表達(dá)而增強(qiáng)乳腺癌、結(jié)腸癌對(duì)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的敏感性[2-3]。NCTD對(duì)白血病細(xì)胞的DR有何影響還不明確，本研究將采用不同濃度NCTD誘導(dǎo)K562和HL-60細(xì)胞，來探討NCTD對(duì)2種白血病細(xì)胞DR5表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白血病細(xì)胞K562和HL-60引自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American type culture collection，ATCC),液氮中凍存。NCTD 購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心； PE標(biāo)記鼠抗人DR5單抗、 抗人JNK1抗體購自eBioscinedce公司(美國)；HRP標(biāo)記羊抗兔和羊抗鼠二抗購自北京中杉公司?；钚匝跆结橂p氯熒光黃乙酸乙酯(Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA) 和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)前1周復(fù)蘇細(xì)胞，以含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，用培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度為3×105/mL,按10 mL/孔接種于培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)8 h后加入不同濃度NCTD(0、5、10和20 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，收集細(xì)胞，完成后繼實(shí)驗(yàn)。

1.3 DR5表達(dá)分析

收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后，調(diào)為密度2×106/mL的細(xì)胞懸液。取200 μL細(xì)胞懸液，加入2 μL PE標(biāo)記鼠抗人DR5抗體,對(duì)照組加入PE標(biāo)記同型對(duì)照抗體；震蕩混勻后室溫避光反應(yīng)30 min；PBS洗滌2次后重懸于500 μL PBS；立即用流式細(xì)胞儀分析。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測

收集細(xì)胞，用PBS調(diào)為密度2×106/mL的細(xì)胞懸液，取500 μL細(xì)胞懸液，加入DCFH-DA儲(chǔ)存液，至其終濃度為5 μmol/L，混勻后37 ℃避光反應(yīng)30 min，PBS 洗2次后用流式細(xì)胞儀分析。

1.5 免疫印跡

收集不同濃度NCTD(0和10 μmol/L) 處理16 h后細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞后提取總蛋白，變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)印電泳將蛋白轉(zhuǎn)于PVDF膜。室溫下用含5%脫脂奶粉的TBS封閉膜2 h，將膜與稀釋的一抗(抗JNK1和β-actin 抗體)在4 ℃條件下反應(yīng)過夜。次日，室溫下用0.5%Tween20/TBS洗3次后，加入二抗并孵育2 h，洗膜3次后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測特異條帶。

2 結(jié) 果

2.1 NCTD上調(diào)白血病細(xì)胞DR5表達(dá)

不同濃度 NCTD誘導(dǎo)16 h后，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞膜表面 DR5表達(dá)，取3次試驗(yàn)DR5陽性細(xì)胞百分率的均值代表試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)NCTD以濃度依賴的方式上調(diào)了2種白血病細(xì)胞DR5的表達(dá)(表1)。

2.2 NCTD增加白血病細(xì)胞內(nèi)活性氧含量

DCFH-DA 進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解為DCFH，該物質(zhì)被氧化后生成DCF，而DCF 發(fā)射的黃綠色熒光可采用流式細(xì)胞儀檢測,其熒光強(qiáng)度值代表細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量。結(jié)果表明，2種白血病細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量均隨NCTD濃度增大而增加(表2)。

表 1 不同濃度NCTD對(duì)DR5表達(dá)的影響(%)

*與對(duì)照組和低濃度組比較，P<0.05

表 2 不同濃度NCTD對(duì)ROS相對(duì)含量的影響

*與對(duì)照組和低濃度組比較，P<0.05

2.3 NCTD增加白血病細(xì)胞JNK1表達(dá)

與對(duì)照組比較，10 μmoL/LNCTD導(dǎo)致2種細(xì)胞內(nèi)JNK1顯著增加(圖1)。

圖 1 NCTD對(duì) JNK1表達(dá)的影響

3 討 論

斑蝥入藥已有2000余年，其藥效成分NCTD是化療藥物中少有的無骨髓抑制毒性制劑。NCTD體外抑瘤的IC50為15～50 μmol/L，其殺傷腫瘤細(xì)胞主要機(jī)制為抑制細(xì)胞有絲分裂和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但近年發(fā)現(xiàn)，NCTD具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化，阻止腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的作用；以及調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相關(guān)的應(yīng)激途徑，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)其他化療藥物敏感性的效應(yīng)[4]。細(xì)胞內(nèi)活性氧過量堆積可導(dǎo)致JNKs等激酶活化，ROS/JNKs為細(xì)胞內(nèi)重要的應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路，當(dāng)細(xì)胞處于不良環(huán)境下JNK的活化可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加[5-7]。CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子，JNK參與CHOP的磷酸化和激活，而DR5是JNK/CHOP調(diào)控重要靶基因[6]。本研究結(jié)果提示，NCTD可能通過ROS/JNK途徑上調(diào)DR5表達(dá)。理論而言，NCTD可能通過ROS/JNKs通路調(diào)節(jié)DR5表達(dá)，而與TRAIL協(xié)同誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，但在白血病患者體內(nèi)是否可獲得較好療效還需要深入探索。

[1] 張金梅,吳 杰,常 城,等.去甲斑蝥素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中國腫瘤生物治療雜志,2011,18(1):33-37.

[2] 李 妍,金伯泉.可溶型細(xì)胞因子受體產(chǎn)生機(jī)制的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012,28(5):551-553,556.

[3] Geserick P,Drewniok C,Hupe M,et al.Suppression of cFLIP is sufficient to sensitize human melanoma cells to TRAIL- and CD95L-mediated apoptosis[J].Oncogene,2008,27(22):3211-3220.

[4] Li Ying,Sun Yan,Liu Fuyou,et al.Norcantharidin inhibits renal interstitial fibrosis by blocking the tubular epithelial-mesenchymal transition[J].PLoS One,2013,8(6):e66356.

[5] Farimani M M,Sarvestani N N,Ansari N,et al.Calycopterin promotes survival and outgrowth of neuron-like PC12 cells by attenuation of oxidative- and ER-stress-induced apoptosis along with inflammatory response[J].Chem Res Toxicol,2011,24(12):2280-2292.

[6] Gopalan A,Yu Weiping,Sanders B G,et al.Simvastatin inhibition of mevalonate pathway induces apoptosis in human breast cancer cells via activation of JNK/CHOP/DR5 signaling pathway[J].Cancer Lett,2013,329(1):9-16.

The study of DR5 on leukemia cells induced by NCTD

LI Yan,ZHANG Duo,FANG Fang,CHEN Shuang,ZHAO Liang-zhong

(School of of Medical Laboratory,Jilin Medical College,Jilin City，Jilin Province,132013，China)

Objective To explore the expression of DR5 on leukemia cells induced by NCTD. Methods Leukemia cells K562 and HL-60 were cultured in vitro and treated by different concentration of NCTD for 16 hours.The expression of DR5 and ROS in cells were measured by flow cytometry,and the content of JNK1 in cells was detected by westernblot assay. Results It was found that NCTD could up-regulated DR5 on leukemia cells in a dose-dependent manner.Both the levels of ROS and JNK1 rise with increasing in the concentration of NCTD. Conclusion The expression of DR5 on leukemia cells could be up-regulated by NCTD through ROS/JNK signaling pathway.

NCTD；ROS；TRAIL；DR5

1673-2995(2014)01-0005-03

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2011420)；吉林省科技廳中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才及團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(20130521018JH)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(82102953).

李 妍(1972-)，女(漢族)，教授，博士.

R392

A

2013-10-07)