甜瓜細(xì)菌性果斑病生防菌株BW-6的篩選和鑒定

吳麗媛，劉寶玉，王鈺杰，劉雙平，趙廷昌，胡 俊*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古巴彥淖爾市植保植檢站，臨河 015000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

甜瓜細(xì)菌性果斑病生防菌株BW-6的篩選和鑒定

吳麗媛1，劉寶玉2，王鈺杰2，劉雙平2，趙廷昌3，胡 俊1*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古巴彥淖爾市植保植檢站，臨河 015000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

甜瓜細(xì)菌性果斑病是由西瓜嗜酸菌(AcidovoraxcitrulliSchaad et al.)引起的一種毀滅性病害。本研究以西瓜嗜酸菌為指示菌，采集97個(gè)土樣,采用土壤稀釋平板法和對(duì)峙培養(yǎng)進(jìn)行拮抗菌的分離和篩選，獲得19株細(xì)菌可以抑制西瓜嗜酸菌生長(zhǎng)。通過離體葉片、盆栽試驗(yàn)進(jìn)行生測(cè)，BW-6菌株對(duì)甜瓜果斑病的生防效果最好，且比較穩(wěn)定，防效達(dá)80.3%。在甜瓜葉面進(jìn)行室外定殖試驗(yàn)表明，BW-6菌株可以在甜瓜葉面上大量定殖，但隨著時(shí)間的推移菌數(shù)逐漸減少。根據(jù)菌株BW-6的形態(tài)特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析綜合考察,鑒定其為枯草芽胞桿菌(BacillussubtilisCohn)。

甜瓜； 細(xì)菌性果斑??； 生物防治； 枯草芽胞桿菌

厚皮甜瓜是內(nèi)蒙古巴彥淖爾市重要的經(jīng)濟(jì)作物，種植厚皮甜瓜是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民致富的主要途徑。隨著種子的調(diào)運(yùn)，由西瓜嗜酸菌(AcidovoraxcitrulliSchaad et al.)引起的細(xì)菌性果斑病(bacterial fruit blotch，BFB)發(fā)生逐年加重，成為當(dāng)?shù)睾衿ぬ鸸仙献钪匾臍缧苑N傳病害。目前防治該病害主要采用化學(xué)藥劑對(duì)種子消毒處理和田間噴灑殺菌劑的方法，農(nóng)用硫酸鏈霉素是常用且防效較好的藥劑。生產(chǎn)中很難做到科學(xué)合理地使用殺菌劑，不僅造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留，還引起病原菌產(chǎn)生抗藥性。生物防治是綠色植保的重要內(nèi)容，在某些病害防治中已有應(yīng)用，而關(guān)于果斑病生物防治研究的報(bào)道很少。目前國(guó)內(nèi)只報(bào)道酵母菌(PichiaanomalaKurtzman)[1]、熒光假單胞菌[Pseudomonasfluorescence(Trev.) Migula]工程菌株(染色體整合了2，4-二乙?；g苯三酚)[2]、內(nèi)生芽胞桿菌(Bacillusspp．)[3]等對(duì)果斑病菌的抑制研究。本試驗(yàn)從采自內(nèi)蒙古各地土樣中分離和篩選出1株對(duì)西瓜嗜酸菌有較好抑制效果和經(jīng)生測(cè)對(duì)果斑病防效顯著的菌株，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤樣品：分別采自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣、呼和浩特市武川縣、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)等地的甜瓜、玉米、燕麥、向日葵、大豆、胡蘿卜等田塊。

供試菌株：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室保存的西瓜嗜酸菌菌株。

培養(yǎng)基：KB培養(yǎng)基(蛋白胨 20.0 g，甘油 10.0 g，K2HPO41.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，瓊脂 17.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH7.2)。

1.2 拮抗菌的分離

采用土壤稀釋平板法[4]進(jìn)行分離。28 ℃培養(yǎng)24 h后挑取具有明顯差異特征的菌落，平板畫線純化，編號(hào)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生防菌的初次篩選

以西瓜嗜酸菌菌株XJ-1為靶標(biāo)菌，將其活化后制成菌懸液均勻涂布于KB平板上，再在平板上均勻點(diǎn)種拮抗菌，28 ℃培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行觀察，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。然后將具有拮抗效果的菌株進(jìn)行5次繼代培養(yǎng)，選擇拮抗效果穩(wěn)定的菌株進(jìn)行研究。

1.4 離體葉片測(cè)定防效

從實(shí)驗(yàn)室盆栽的甜瓜幼苗上取第一片真葉，分別浸沒在拮抗菌(供試菌株BW-6、BYP-28、NG-29)菌懸液(菌液濃度為108cfu/mL)中1 min，晾干至表面無水珠，然后將西瓜嗜酸菌菌懸液(菌液濃度為108cfu/mL)均勻噴于處理葉片正、背面，置于滅菌的水瓊膠平板上，26 ℃保濕，觀察發(fā)病情況。以只接種西瓜嗜酸菌的葉片和只噴KB培養(yǎng)液的葉片為對(duì)照。每處理各5片葉，3次重復(fù)。

1.5 盆栽測(cè)定防效

經(jīng)拮抗性篩選和離體葉片測(cè)定，將效果較好的菌株通過盆栽試驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定其穩(wěn)定性和防病效果。當(dāng)甜瓜苗長(zhǎng)至2～3片真葉時(shí)，將拮抗性較好的菌株菌懸液(菌液濃度為108cfu/mL)分別噴施到真葉上，晾干后噴霧法接種西瓜嗜酸菌(菌液濃度為108cfu/mL)于葉片正、背面， 30 ℃下連續(xù)保濕24 h后常規(guī)管理，觀察發(fā)病情況，調(diào)查病情指數(shù)，計(jì)算防治效果。本試驗(yàn)供試拮抗菌菌株BW-6、BYP-28、NG-29，以只接種西瓜嗜酸菌和只噴KB培養(yǎng)液的處理為對(duì)照。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)15株。反復(fù)驗(yàn)證3次。

1.6 拮抗菌株在甜瓜葉面上定殖情況的測(cè)定

將防病效果最好且穩(wěn)定的BW-6菌株用于在甜瓜葉面定殖情況的測(cè)定。選擇硫酸鏈霉素作為菌株BW-6抗性標(biāo)記藥劑，把BW-6在KB培養(yǎng)基上畫線活化，挑取單菌落轉(zhuǎn)入含硫酸鏈霉素 5 μg/mL的 KB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，然后在含硫酸鏈霉素 5 μg/mL 的KB培養(yǎng)基平板上畫線培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落后挑取其轉(zhuǎn)入下一個(gè)梯度濃度中，依次經(jīng)過含10、20、40、80、160、200 μg/mL硫酸鏈霉素的KB培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，直至篩選出在含有200 μg/mL硫酸鏈霉素的KB培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)、拮抗性以及菌落形態(tài)不變的BW-6抗性標(biāo)記菌株。

將該抗性標(biāo)記菌株接種于盛有100 mL KB培養(yǎng)液的三角瓶?jī)?nèi)，加終濃度為200 μg/mL的硫酸鏈霉素，28 ℃下振蕩培養(yǎng)48 h，用無菌水制成108cfu/mL的菌懸液，噴霧于甜瓜葉片，處理20株，以噴KB培養(yǎng)液的處理作對(duì)照。自處理后至15 d，每天取樣測(cè)定。測(cè)定方法是稱取1 g葉片放入無菌研缽中研碎，定容至10 mL，然后梯度稀釋至102、103、104、105、106、107、108、109倍，各濃度分別用移液槍移取100 μL均勻涂布在加有終濃度為200 μg/mL的硫酸鏈霉素的KB平板上，28 ℃下培養(yǎng)48 h后，統(tǒng)計(jì)各平板上能夠生長(zhǎng)、菌落形態(tài)不變的BW-6菌落數(shù)量，計(jì)算菌株BW-6的定殖數(shù)量。

1.7 菌株BW-6的鑒定

1.7.1 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

將菌株BW-6在KB平板上于28 ℃培養(yǎng)24 h,觀察其菌落形態(tài)，并參照東秀珠等《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]的方法進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)。

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]，對(duì)菌株BW-6進(jìn)行熒光反應(yīng)、V-P測(cè)定、接觸酶、硝酸鹽還原、明膠液化、淀粉水解、檸檬酸的利用、丙二酸鈉的利用、甲基紅試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸、耐鹽性等生理生化試驗(yàn)。

1.7.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株BW-6采用CTAB法[6]提取其總基因組。

菌株BW-6的16S rDNA PCR擴(kuò)增體系、方法及所使用的27F和1 492 r通用引物序?yàn)椋?7F：5′-AGAGTATTGATCATGGCTCAG-3′與1 492 r：5′-TACGGTTCCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系：DNA(70 ng/μL)模板2 μL；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3.5 μL；27F(20 μmol/L)1.0 μL；1 492 r(20 μmol/L)1.0 μL；10×Buffer(Mg2+plus)5 μL；TaqDNA 聚合酶0.5 μL；補(bǔ)足ddH2O 到50 μL。PCR 條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸2.0 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

PCR產(chǎn)物測(cè)序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。所測(cè)序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast程序進(jìn)行相似性比較。由GenBank中得到相關(guān)菌株的序列，與本文所測(cè)得序列一起輸入MEGA 5.0軟件，以Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果分析

2.1 拮抗菌的分離及篩選

從采集的97個(gè)土樣中共分離得到2 945株細(xì)菌，初篩127株有抑菌效果，經(jīng)過5次繼代培養(yǎng)，19株有抑菌作用，其中8株細(xì)菌的抑菌效果較好，結(jié)果見表1。

表18株拮抗菌對(duì)西瓜嗜酸菌的抑制效果

Table1Inhibitoryeffectsof8strainsonAcidovoraxcitrulli

菌株Strain抑菌帶寬度/mmInhibitoryzoneBH?53．8311?264．80BYP?285．33NG?294．50菌株Strain抑菌帶寬度/mmInhibitoryzoneBB?205．00NG?264．50BS3?273．17BW?68．00

2.2 離體葉片上的防效

觀察在離體葉片的測(cè)定結(jié)果，各拮抗菌株對(duì)甜瓜果斑病的生防效果有差異，其中菌株BW-6、BYP-28、NG-29生防效果較好，如圖1所示，上排為未噴拮抗菌對(duì)照，下排為噴施拮抗菌處理。菌株NG-26、BS3-27的效果較差。菌株BH-5和11-26對(duì)葉片組織表現(xiàn)明顯的毒害作用。

暴雨雨日最多發(fā)生在夏季,2001—2016年間有47 d的暴雨發(fā)生在夏季,占總數(shù)的70.1%,其中70 mm以上暴雨雨日19 d,100 mm以上暴雨雨日6 d,春季和秋季次之,分別為11 d、占比16.4%和8 d、占比11.9%,冬季最少僅有1 d,僅占1.5%(圖3)。

圖1 3株拮抗菌對(duì)甜瓜果斑病離體葉片防治效果Fig.1 Inhibitory effects of 3 strains on detached leaves of sweet melon against Acidovorax citrulli

2.3 盆栽條件下的防效

室內(nèi)盆栽條件下測(cè)定BW-6、BYP-28、NG-29菌株對(duì)甜瓜細(xì)菌性果斑病防治效果表明，用BW-6、BYP-28、NG-29菌株處理后對(duì)果斑病的防效分別為80.3%、66.7%、72.9%(表2)。只接種病原菌XJ-1的處理在連續(xù)保濕3 d后即發(fā)病，而經(jīng)NG-29、BYP-28菌株處理的在連續(xù)保濕5 d后輕微發(fā)病，經(jīng)BW-6菌株處理的在連續(xù)保濕7 d時(shí)才輕微發(fā)病。3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明，BW-6菌株的防治效果最好、最穩(wěn)定。

表23株拮抗菌在盆栽條件下對(duì)甜瓜苗病情指數(shù)的影響1)

Table2Effectsof3antagonisticbacterialstrainsonthediseaseindexofsweetmelon

處理Treatment病情指數(shù)Diseaseindex防治效果/%ControleffectBW?612．7D80．3NG?2917．5C72．9BYP?2821．5B66．7CK64．6A-

1) A、B、C、D代表在0.01水平上顯著差異。 A, B, C and D indicate highly significant difference (P<0.01).

2.4 拮抗菌株在甜瓜葉面上的定殖

室外測(cè)定BW-6菌株在甜瓜葉面上的定殖能力，結(jié)果見圖2。在接種后14 d內(nèi)，種群數(shù)量整體有下降趨勢(shì)。在接種第3～4天時(shí)，BW-6菌株在甜瓜葉片上的生長(zhǎng)菌量達(dá)到最大，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，直到第14天時(shí)葉面上的生長(zhǎng)菌量已經(jīng)非常小，降至1.0×102cfu/mL。

圖2 BW-6菌株在甜瓜葉面上的種群動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamics of the strain BW-6 on the leaf surface of sweet melon under field condition

2.5 鑒定結(jié)果

2.5.1 形態(tài)特征和生理生化特性

菌株BW-6在KB固體培養(yǎng)基上菌落白色不透明，邊緣不整齊，表面粗糙，革蘭氏陽(yáng)性；細(xì)胞直桿狀，(0.6～0.8)μm×(2～3)μm；芽胞柱狀，大小(0.5～0.7)μm×(1.0～1.5)μm，位于菌體中央或者稍偏一端，芽胞形成后菌體不膨大(見圖3)。

表3菌株BW-6生理生化特征

Table3PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrainBW-6

測(cè)定項(xiàng)目Itemtested菌株BW?6StrainBW?6對(duì)照菌株BacillussubtilisControlstrain革蘭氏染色Gramstain++熒光反應(yīng)Fluorescencereaction--V?P測(cè)定(V?Ptest)++接觸酶Catalase++硝酸鹽還原Nitratereduction++明膠液化Gelatinliquefaction++淀粉水解Amylolysis++檸檬酸的利用Utilizationofcitricacid++丙二酸鈉的利用Utilizationofmalonicacidsodium--甲基紅試驗(yàn)Methylredtest++產(chǎn)酸：葡萄糖Fermentationofglucoseandacidproduction++2%NaCl++5%NaCl++4℃生長(zhǎng)Growthat4℃--30℃生長(zhǎng)Growthat30℃++50℃生長(zhǎng)Growthat50℃++

圖3 BW-6菌株形態(tài)特征Fig.3 The morphology of strain BW-6

2.5.2 菌株BW-6的分子生物學(xué)鑒定

以菌株BW-6的總基因組為模板利用27F、1 492 r 引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，得到一條清晰明亮的條帶，長(zhǎng)約為1 500 bp。經(jīng)比對(duì)結(jié)果表明：得到菌株BW-6的16S rDNA核酸序列與枯草芽胞桿菌[Bacillussubtilis(Ehrenberg) Cohn]的相似性最高，為99.00%。根據(jù)16S rDNA序列對(duì)菌株BW-6及相近菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明菌株BW-6與枯草芽胞桿菌的親緣關(guān)系最近(圖4)。結(jié)合BW-6的菌體形態(tài)、革蘭氏染色反應(yīng)、培養(yǎng)性狀、生理生化測(cè)定結(jié)果，得出菌株BW-6為枯草芽胞桿菌(B.subtilis)。

圖4 菌株BW-6 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain BW-6 and its relatives

3 討論

近些年，植物病害化學(xué)防治伴隨著環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留，病原菌產(chǎn)生抗藥性等問題，給生產(chǎn)帶來諸多不便，故利用生防菌及其所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行病害防治成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)在病害生物防治研究方面已有很多報(bào)道，如李寶慶等[7]用枯草芽胞桿菌防治番茄灰霉病，薛東紅等[8]篩選出對(duì)黃瓜枯萎病有強(qiáng)烈抑制作用的蠟狀芽胞桿菌，但枯草芽胞桿菌防治瓜類果斑病的研究在國(guó)內(nèi)還未見報(bào)道。

本研究經(jīng)過篩選，枯草芽胞桿菌BW-6菌株在固體平板上抑菌帶寬達(dá)到8 mm，盆栽防效為80.3%，且防治效果穩(wěn)定。該菌株在甜瓜葉片上易定殖，葉片上的菌量能在較短時(shí)間內(nèi)迅速上升，為以后在田間甜瓜葉片上噴施應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。由于室內(nèi)和田間的氣候、環(huán)境條件不同，且田間環(huán)境比較復(fù)雜，該菌株施用于田間后能否穩(wěn)定、持久地發(fā)揮其抑菌防病作用仍需進(jìn)一步研究。另外，要進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，促進(jìn)其更加有效地抑制西瓜嗜酸菌，同時(shí)對(duì)西瓜嗜酸菌的抑制機(jī)理，需要具體研究?？莶菅堪麠U菌能夠產(chǎn)生耐熱、抗紫外線和有機(jī)溶劑的芽胞[9-10]，其芽胞可以制成粉劑、可濕性粉劑等劑型用于田間使用或與部分化學(xué)農(nóng)藥混用而并不喪失其抑菌活性[11]，且對(duì)人畜安全，不會(huì)造成環(huán)境污染，具有成為有效生防菌劑的潛力。

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Isolationandidentificationofbio-controlbacterialstrainBW-6againstbacterialfruitblotchofsweetmelon

Wu Liyuan1,Liu Baoyu2,Wang Yujie2,Liu Shuangping2,Zhao Tingchang3,Hu Jun1

(1.CollegeofAgriculture,AgriculturalUniversityofInnerMongolia,Hohhot010019,China；2.BayannurCityStationofPlantProtection,InnerMongolia,Linhe015000,China;3.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Bacterial fruit blotch of sweet melon, caused byAcidovoraxcitrulli, is a devastating bacterial disease.Nineteen strains with highly antagonistic activity were isolated from 97 soil samples using dilution plate and dual culture method.In this study,A.citrulliwas an indicator.Strain BW-6 showed high and stable antagonistic effect both on detached leaves and pot experiment, and its control efficiency was 80.3%.Experiment on leaves of sweet melon indicated that strain BW-6 was able to colonize on leaves, but the quantity of bacteria tended to drop off over time.Strain BW-6 was identified asBacillussubtilisby its morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis.

sweet melon; bacterial fruit blotch; biological control;Bacillussubtilis

2013-04-09

： 2013-06-07

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003066)

S 476

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.007

* 通信作者 E-mail:hujun6202@126.com