急性淋巴細(xì)胞白血病患兒葉酰多聚谷氨酸合成酶和γ-谷氨酰水解酶基因表達(dá)與大劑量甲氨蝶呤療效相關(guān)性

李 越 文飛球 陳小文 麥惠容 袁秀麗 李長(zhǎng)鋼

·論著·

急性淋巴細(xì)胞白血病患兒葉酰多聚谷氨酸合成酶和γ-谷氨酰水解酶基因表達(dá)與大劑量甲氨蝶呤療效相關(guān)性

李 越1文飛球1陳小文2麥惠容1袁秀麗1李長(zhǎng)鋼1

目的 研究葉酰多聚谷氨酸合成酶(FPGS)、γ-谷氨酰水解酶(GGH)基因表達(dá)水平在急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患兒和正常兒童中是否存在差異，并分析不同基因表達(dá)水平與大劑量甲氨蝶呤(MTX)療效、毒副作用及預(yù)后的相關(guān)性。方法 以深圳市兒童醫(yī)院(我院)血液科收治的ALL初診且接受大劑量MTX化療患兒為ALL組，以非造血系統(tǒng)惡性疾病兒童為對(duì)照組；采用SYBR Green熒光定量RT-PCR檢測(cè)ALL組骨髓和對(duì)照組外周血中FPGS與GGH基因相對(duì)表達(dá)水平，比較ALL組和對(duì)照組FPGS與GGH基因表達(dá)水平差異。進(jìn)一步按照ALL組FPGS、GGH基因表達(dá)水平的中位數(shù)分為相應(yīng)的高表達(dá)亞組和低表達(dá)亞組，分析FPGS、GGH不同表達(dá)亞組MTX療效、毒副作用及預(yù)后的差異。結(jié)果 2003年1月至2013年12月61例ALL患兒進(jìn)入分析，男39例，女22例，平均年齡4.6歲；對(duì)照組納入30例，男19例，女11例，平均年齡4.2歲。ALL組FPGS、GGH基因相對(duì)表達(dá)水平及其比值中位數(shù)(P25～P75)分別為14.14(6.52～27.31)、9.34(4.97～14.22)和1.74(0.76～2.91)，對(duì)照組分別為0.59(0.3～1.23)、3.00(0.94～5.26)和0.26(0.13～1.00)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。FPGS高表達(dá)和低表達(dá)亞組復(fù)發(fā)率分別為3.7% (1/27)和23.3% (7/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。FPGS基因表達(dá)水平升高增加發(fā)生中性粒細(xì)胞減少的風(fēng)險(xiǎn)(OR=4.17，95%CI：1.65～10.52,P=0.003)。GGH基因高表達(dá)水平增加肝毒性的風(fēng)險(xiǎn)(OR=5.61，95%CI ：1.14～27.47，P=0.033)。未觀察到FPGS/GGH比值對(duì)MTX療效及毒副作用的影響。結(jié)論 ALL患兒FPGS、GGH基因表達(dá)水平及其比值高于正常兒童；FPGS基因表達(dá)水平對(duì)ALL患兒大劑量MTX療效及毒副作用有一定的影響。

葉酰多聚谷氨酸合成酶； γ-谷氨酰水解酶； 基因表達(dá)； 急性淋巴細(xì)胞白血??； 兒童

抗葉酸類藥物甲氨喋呤(MTX)是兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)鞏固和維持化療的重要藥物，約80%的患兒對(duì)應(yīng)用MTX治療獲得較好的臨床反應(yīng)，但仍有部分患兒出現(xiàn)耐藥或者嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，需減少M(fèi)TX劑量甚至終止治療[1]。由于患兒間MTX藥動(dòng)學(xué)、療效和毒性存在個(gè)體差異，臨床通常監(jiān)測(cè)MTX血藥濃度指導(dǎo)個(gè)體化用藥以提高療效并減少毒副作用發(fā)生。葉酰多聚谷氨酸合成酶(FPGS)和γ-谷氨酰水解酶(GGH)是葉酸和葉酸拮抗劑細(xì)胞內(nèi)代謝過程中的關(guān)鍵酶。FPGS催化葉酸及其衍生物、葉酸拮抗劑的聚谷氨酸化，GGH裂解葉酸及抗葉酸類藥物多聚谷氨酸鹽的谷氨酸殘基，兩者是維持體內(nèi)葉酸平衡和細(xì)胞增殖必不可少的酶系[2]。MTX多聚谷氨酸(MTXPG)是MTX發(fā)揮抗白血病作用的重要活性形式，其水平高低是FPGS和GGH兩者活性協(xié)同作用的結(jié)果，細(xì)胞內(nèi)MTX和MTXPG的累積與白血病患兒化療療效和無病生存相關(guān)[3]，因此兩者活性及其比值在MTX體內(nèi)抗白血病效應(yīng)中起重要作用[4]。

FPGS和GGH均是MTX藥動(dòng)學(xué)中關(guān)鍵代謝酶，目前報(bào)道較多的是基因多態(tài)性、MTX耐藥和藥動(dòng)學(xué)的研究，F(xiàn)PGS基因和GGH基因表達(dá)水平與ALL患兒臨床結(jié)局是否存在相關(guān)性？非常有必要進(jìn)行研究。

1 方法

1.1 研究設(shè)計(jì) 本文以病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，回顧性收集ALL患兒作為病例組，非造血系統(tǒng)惡性疾病兒童為對(duì)照組，比較兩組FPGS和GGH基因表達(dá)；并分析ALL組FPGS和GGH基因不同表達(dá)水平亞組與MTX療效、毒副作用及預(yù)后的相關(guān)性。

1.2 倫理和知情同意 本研究獲得深圳市兒童醫(yī)院(我院)生物倫理委員會(huì)審核同意。骨髓液采集及基因表達(dá)檢測(cè)獲得了ALL患兒家長(zhǎng)的知情同意。

1.3 ALL診斷和分型標(biāo)準(zhǔn) ALL的診斷、分型、危險(xiǎn)度分型均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組制定的方案[5,6]。

1.4 ALL組納入標(biāo)準(zhǔn)及亞組 ①2003年1月至2013年12月我院血液科收治的ALL初發(fā)且留有化療及輸血前骨髓標(biāo)本的病例；②采用大劑量 MTX(HD-MTX)化療的病例，其中標(biāo)危型和中危型患兒予MTX 2 g·m-2×4，高危型患兒予MTX 5 g·m-2×4)化療的病例。并以ALL組FPGS、GGH基因表達(dá)水平及其比值的中位數(shù)，分為相應(yīng)的高表達(dá)和低表達(dá)亞組。

1.5 對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn) ①上呼吸道感染或兒童保健體檢兒童；②與ALL組年齡、性別盡量匹配；③血生化檢查的剩余血標(biāo)本量足以行本研究基因檢測(cè)。

1.6 ALL治療方案 采用GZ2002 ALL方案或GD2008 ALL方案，應(yīng)用HD-MTX+甲酰四氫葉酸鈣(CF)方案預(yù)防髓外白血病，兩方案HD-MTX+CF應(yīng)用相同。HD-MTX治療前要求一般情況良好，無嚴(yán)重感染；心電圖、心肌酶譜、肝腎功能均正常，符合化療條件。鞏固化療時(shí)標(biāo)危型和中危型患兒接受4輪HD-MTX治療，并每晚頓服巰嘌呤25 mg·m-2·d-1，高危型患兒接受2輪共4次HD-MTX治療。所有患兒均用CF解救MTX毒性。HD-MTX化療前使用止吐藥；為防止口腔和肛周感染，化療期間每日0.1%洗必泰溶液漱口，0.05%利凡諾溶液坐??；為保護(hù)消化道黏膜，每日思密達(dá)含漱后口服。

1.7 不良反應(yīng)統(tǒng)計(jì) 查閱病史評(píng)估每輪HD-MTX輸注后至下輪開始間或每次HD-MTX輸注后14 d內(nèi)的毒副作用。毒副作用分級(jí)采用美國(guó)國(guó)立癌癥研究所的第4版常規(guī)毒性判定標(biāo)準(zhǔn)，≥2級(jí)者為明顯毒副作用。①外周血Hb、中性粒細(xì)胞和PLT評(píng)估骨髓抑制情況；②血清ALT、AST水平評(píng)估肝臟毒性；③SCr和BUN水平評(píng)估腎毒性；④以心率、心律、心功能情況及心肌酶譜水平評(píng)估心臟毒性；⑤以情緒障礙、失眠、嚴(yán)重頭痛、驚厥和癱瘓等評(píng)估神經(jīng)系統(tǒng)毒性反應(yīng)；⑥以惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛和腸梗阻等評(píng)估消化道毒性；⑦口腔黏膜損害單獨(dú)作為一項(xiàng)進(jìn)行評(píng)估。

1.8FPGS和GGH基因相對(duì)表達(dá)檢測(cè)

1.8.1 總RNA提取及cDNA的制備 初次發(fā)病的ALL患兒骨髓液(白血病細(xì)胞比例>80%)1～1.5 mL，對(duì)照組兒童采集靜脈血0.5～2 mL，使用QIAamp?RNA Blood Mini Kit(QIAGEN，德國(guó))抽提總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度。1 μg總 RNA使用禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(大連寶生物公司)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA， -80℃凍存，采用樣本庫(kù)標(biāo)本一次性完成實(shí)驗(yàn)。

1.8.2 熒光定量PCR 根據(jù)FPGS基因的mRNA序列(NCBI序列號(hào)：M98045.1)，GGH基因mRNA序列(NCBI序列號(hào)：NM_003878),采用Prime Premier 5.0 軟件自行設(shè)計(jì)引物, BLAST比對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，以β-actin為內(nèi)參。引物參數(shù)分別為：FPGS(上游引物:5′CATGGAGTACCAGG-ATGCCG 3′, 下游引物: 5′CGTGCCAGGTACAGTTCCAT 3′, 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度130 bp)；GGH(上游引物:5′CCAAGAAG-CCCATCATCGGAA 3′, 下游引物: 5′ACTGGTACAACTC-TCGCACC 3′, 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度130 bp)；β-actin (上游引物:5′CGCGGCTACAGCTTCACCAC 3′, 下游引物: 5′GGAAGCAGCCGTGGCCAT 3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度112 bp) ；按照本實(shí)驗(yàn)室已建立的SYBR Green相對(duì)定量熒光定量PCR法進(jìn)行：應(yīng)用購(gòu)自Roche公司的LightCycler?480 SYBR GreenⅠMaster, 總反應(yīng)體系20 μL, 2×MasterMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0. 4 μL, RNase-Free Water 9 μL, RT反應(yīng)產(chǎn)物0.2 μL。在LightCycler?480 Ⅱ熒光定量PCR 儀(Roche)進(jìn)行擴(kuò)增和分析，采用96 孔反應(yīng)模塊。每份標(biāo)本均做3管平行檢測(cè)(即3管檢測(cè)β-actin基因作為內(nèi)參, 3管檢測(cè)目的基因)，擴(kuò)增參數(shù)為：95℃ 10 min, 再95℃ 10 s, 60℃ 25 s, 72℃ 20 s, 45 次循環(huán)。擴(kuò)增完畢后,進(jìn)行熔解曲線分析，95℃ 5 s, 65℃ 60s，以0.1℃·s-1的速度升溫至97℃，連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性分析。使用LightCycler?480Ⅱ自帶軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合本文納入標(biāo)準(zhǔn)的ALL患兒61例進(jìn)入分析，男39例，女22例，發(fā)病年齡6月齡至13歲，平均年齡為4.6歲；BCP-ALL 58例，T-ALL 3例；2003至2005年ALL患兒診斷依據(jù)文獻(xiàn)[5]，標(biāo)危型9例，高危型7例；2006至2013年ALL患兒診斷依據(jù)文獻(xiàn)[6]，標(biāo)危型20例，中危型15例，高危型10例。61例均獲CR，并完成了鞏固化療。符合本文對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)30例進(jìn)入分析，男19例，女11例，平均年齡 4.2歲(4月齡至12歲)，ALL組和對(duì)照組年齡和性別匹配(P>0.05)。

2.2 ALL組與對(duì)照組FPGS及GGH基因相對(duì)表達(dá)水平比較FPGS、GGH基因擴(kuò)增熔解曲線分析顯示，PCR產(chǎn)物熔解曲線均為銳利的單一峰形，無其他非特異性峰形，說明擴(kuò)增產(chǎn)物特異，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生(圖1)。

圖2顯示， ALL組FPGS、GGH基因相對(duì)表達(dá)水平及其比值的中位數(shù)(P25～P75)分別為14.14(6.52～27.31)、9.34(4.97～14.22)和1.74(0.76～2.91)，對(duì)照組分別為0.59(0.35～1.23)、3.00(0.94～5.26)和0.26(0.13～1.00)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。

圖1FPGS、GGH基因與β-actin相對(duì)定量熔解曲線分析

Fig 1 Melting curve analysis ofFPGS,GGHgene and β-actin in relative quantitative real-time PCR

Notes Single peak of melting curve analysis was displayed inFPGS,GGHgene and β-actin when carrying out relative quantitative real-time PCR by using method of fluorescence dye SYBR GreenⅠ, which showed that specificity of the quantitative real-time PCR was good

圖2 ALL組與對(duì)照組FPGS、GGH基因相對(duì)表達(dá)水平

Fig 2FPGS,GGHgene expression andFPGS/GGHbetween ALL and control groups

Notes A: The median (P25-P75) expression ofFPGSgene in ALL group were 14.14(6.52-27.31), significantly higher than 0.59(0.35-1.23) in the control group；B: The expression ofGGHgene in ALL group were 9.34(4.97-14.22), significantly higher than 3.00(0.94-5.26) in the control group；C: The rate ofFPGStoGGHgene expression in ALL group were 1.74(0.76-2.91), significantly higher than 0.26(0.13-1.00) in the control group

2.3 ALL組FPGS、GGH基因表達(dá)水平及其比值與臨床分型、療效的相關(guān)性 表1顯示，ALL組FPGS基因高表達(dá)亞組(FPGS/β-actin>14.88)30例，F(xiàn)PGS基因低表達(dá)亞組(FPGS/β-actin≤14.88)31例，兩亞組患兒的年齡、性別、臨床分型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FPGS基因高表達(dá)亞組WBC>50×109·L-1占10.0%(3/30)，低表達(dá)亞組占22.6%(7/31)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.761，P=0.185)。FPGS基因高表達(dá)亞組的CR率為90.0 % (27/30)，低表達(dá)組為96.8 % (30/31)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.213,P=0.271)。

ALL組61例中57例具有隨訪資料，57例隨訪14～60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間27.7個(gè)月 ，有8例(14.0%)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其中FPGS基因高表達(dá)亞組復(fù)發(fā)率3.7% (1/27)，F(xiàn)PGS基因低表達(dá)亞組為23.3%(7/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.538，P=0.033)。FPGS基因高表達(dá)亞組無病生存率為86.7%(26/30)，F(xiàn)PGS基因低表達(dá)亞組為74.2% (23/31)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.501，P=0.221)。GGH基因表達(dá)水平及FPGS/GGH比值與臨床分型、療效的相關(guān)性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4FPGS、GGH基因表達(dá)水平及其比值與MTX毒副作用的相關(guān)性 表2顯示，F(xiàn)PGS基因高表達(dá)亞組與中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生率相關(guān)(OR=4.17，95%CI：1.65～10.52,P=0.003)，未觀察到其他毒副作用與FPGS基因表達(dá)水平的相關(guān)性(P>0.05)。GGH基因高表達(dá)水平增加肝毒性的風(fēng)險(xiǎn)(OR=5.61，95%CI ：1.14～27.47，P=0.033)。FPGS/GGH比值與毒副作用未見顯著的相關(guān)性(P>0.05)。

表1 ALL患兒FPGS，GGH基因相對(duì)表達(dá)水平及FPGS/GGH與臨床分型、療效的相關(guān)性[n(%)]

Tab 1 Analysis of correlation betweenFPGS，GGHgene expression ，F(xiàn)PGS/GGHand clinical typing, chemotherapeutic effect in children with ALL[n(%)]

ItemsFPGSexpressionHigh(n=30)Low(n=31)PGGHexpressionHigh(n=30)Low(n=31)PFPGS/GGHexpressionHigh(n=30)Low(n=31)PM/F(n/n)19/1120/110．92318/1221/100．52918/1221/100．529Age/years4．34．70．6344．34．80．4094．74．40．629BCP/T?ALL(n/n)29/129/20．57327/331/00．07128/230/10．534WBC>50×109·L-13(10．0)7(22．6)0．1853(10．0)7(22．6)0．1858(26．7)2(6．5)0．044Completeression27(90)30(96．8)0．27127(90)30(96．8)0．27129(96．7)28(90．3)0．317Relapserate1/27(3．7)7/30(23．3)0．0333/27(11．1)5/30(16．7)0．5475/29(17．2)3/28(10．7)0．478EFS26(86．7)23(74．2)0．22124(80．0)25(80．6)0．94924(80．0)25(80．6)0．949

表2 ALL患兒FPGS，GGH基因相對(duì)表達(dá)水平及FPGS/GGH與MTX毒副作用的相關(guān)性[n(%)]

Tab 2 Analysis of correlation betweenFPGS，GGHgene expression ，F(xiàn)PGS/GGHand toxicity of drug in children with ALL[n(%)]

ItemsFPGSexpressionHigh(n=30)Low(n=31)ORPGGHexpressionHigh(n=30)Low(n=31)ORPFPGS/GGHexpressionHigh(n=30)Low(n=31)ORPNeutropenia15(50．0)6(19．4)4．170．00313(43．3)8(25．8)2．200．08112(40．0)9(29．0)1．630．273Anemia5(16．7)3(9．7)1．460．5184(13．3)4(12．9)0．750．6215(16．7)3(9．7)1．460．518Thrombocytopenia2(6．7)2(6．5)0．900．8842(6．7)2(6．5)0．900．8842(6．7)2(6．5)0．900．884Hepatotoxicity5(16．7)2(6．5)2，740．1606(20．0)1(3．2)5．610．0334(13．3)3(9．7)1．170．813Gatrointestinal7(23．3)12(38．7)0．490．13811(36．7)8(25．8)2，180．1138(25．8)11(35．5)0．830．699Oralmucosadamage5(16．7)1(3．2)4．230．0815(16．7)1(3．2)4．230．0813(16．7)3(9．7)0．600．452

3 討論

MTX是經(jīng)典葉酸拮抗劑，廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的治療。MTX本身的藥理活性并不大，在體內(nèi)必須經(jīng)過一系列的酶催化過程才能發(fā)揮藥理學(xué)作用。MTX結(jié)構(gòu)類似葉酸，經(jīng)還原型葉酸載體運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞后，在FPGS作用下連接上谷氨酸殘基形成MTXPG，穩(wěn)定地停留在細(xì)胞內(nèi)，通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制二氫葉酸還原酶活性，也可間接抑制胸苷酸合成酶活性，使四氫葉酸產(chǎn)生受阻，一碳單位形成減少，影響核酸和蛋白質(zhì)的合成，起到抗腫瘤作用[7]。另一方面，細(xì)胞內(nèi)的MTXPG經(jīng)GGH催化逐漸脫掉谷氨酸殘基直至徹底還原為MTX，然后由ABC蛋白超家族轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。因此，MTXPG濃度受FPGS和GGH共同影響來維持動(dòng)態(tài)平衡。

本研究顯示ALL組的FPGS、GGH基因相對(duì)表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，且ALL組FPGS/GGH比值也顯著高于對(duì)照組，F(xiàn)PGS、GGH的mRNA表達(dá)水平與其活性相關(guān)[4,8]，提示白血病細(xì)胞中FPGS/GGH比值高更有利于MTXPG的形成，從而提高M(jìn)TX藥物療效。有研究發(fā)現(xiàn)B-ALL患者的FPGS活性高于T-ALL患者[4,9]，本研究由于T-ALL患兒病例數(shù)有限，未進(jìn)行相關(guān)分析。

此外，通過比較分析ALL組FPGS、GGH基因表達(dá)水平及其比值與臨床分型、療效的關(guān)系時(shí)，觀察到FPGS基因高表達(dá)亞組復(fù)發(fā)率(3.7%)顯著低于FPGS基因低表達(dá)亞組(23.3%)。而GGH基因表達(dá)水平及FPGS/GGH比值與臨床分型、療效相關(guān)分析未得到陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。有研究顯示GGH基因高表達(dá)可過度地將MTXPG水解成MTX，再?gòu)募?xì)胞中釋放至血液，減少細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度和作用時(shí)間，降低療效[10]。這提示FPGS作為合成MTXPG的關(guān)鍵酶，可能處于更為主導(dǎo)的地位，F(xiàn)PGS基因表達(dá)低時(shí)，合成MTXPG相對(duì)較少，MTX發(fā)揮的抗腫瘤效應(yīng)也小，從而導(dǎo)致療效不足，復(fù)發(fā)率高；而FPGS基因高表達(dá)的ALL患兒對(duì)化療反應(yīng)佳[11]，且只有當(dāng)FPGS表達(dá)較高致MTXPG達(dá)到一定量時(shí)，GGH基因表達(dá)水平及FPGS/GGH比值才可能發(fā)揮作用。

大劑量MTX治療兒童ALL時(shí)毒副作用較為常見，但多輕微，其中骨髓抑制最為常見，其次為消化道反應(yīng)、口腔黏膜損害等。FPGS基因高表達(dá)亞組與中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生率有一定的相關(guān)性，F(xiàn)PGS基因表達(dá)水平升高使發(fā)生中性粒細(xì)胞減少的風(fēng)險(xiǎn)升高，Koomdee等[11]發(fā)現(xiàn)MTX血藥濃度超過治療閾值可能導(dǎo)致毒副反應(yīng)增加。本研究還觀察到FPGS基因高表達(dá)與口腔黏膜損害也可能有一定的相關(guān)性，F(xiàn)PGS基因高表達(dá)組的發(fā)生率(16.7%)高于FPGS基因低表達(dá)組(3.23%)，P=0.081。GGH基因高表達(dá)水平增加肝毒性風(fēng)險(xiǎn)，P=0.033，處于臨界統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與既往研究報(bào)道結(jié)果不符[12]，可能均與樣本量小有關(guān)。未來需要設(shè)計(jì)更加嚴(yán)謹(jǐn)和大樣本的研究，同時(shí)檢測(cè)MTX血藥濃度和GGH活性，驗(yàn)證GGH表達(dá)水平和活性與毒副作用的關(guān)系。

本研究結(jié)果表明對(duì)初發(fā)ALL患兒進(jìn)行FPGS基因表達(dá)檢測(cè)有一定的臨床指導(dǎo)意義，其表達(dá)水平和復(fù)發(fā)率呈負(fù)相關(guān)，在一定程度上可作為判斷化療效果的預(yù)后因子。

本研究的不足之處和局限性：①動(dòng)態(tài)檢測(cè)MTX血藥濃度，對(duì)于分析FPGS和GGH基因表達(dá)水平與MTX濃度的關(guān)系更有意義；②與MTX療效，毒性和預(yù)后存在相關(guān)性除了FPGS和GGH代謝關(guān)鍵酶，還有MTX轉(zhuǎn)運(yùn)、作用靶點(diǎn)相關(guān)的還原型葉酸載體、胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶、亞甲基四氫葉酸還原酶的基因多態(tài)性及表達(dá)水平[13～16]。

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(本文編輯：丁俊杰)

Study on the correlation between expressions of folypolyglutamate synthetase and gamma-glutamyl hydrolase genes and efficacy and toxicity of methotrexate in childhood acute lymphoblastic leukemia

LIYue1,WENFei-qiu1，CHENXiao-wen2，MAIHui-rong1,YUANXiu-li1,LIChang-gang1

(1DepartmentofHematology, 2ShenzhenInstituteofPediatrics,ShenzhenChildren'sHospital，Shenzhen518038，China)

Corresponding Author：WEN Fei-qiu，E-mail:fwen62@126.com; CHEN Xiao-wen，E-mail:cxwbrian@aliyun.com

ObjectiveThe activities of folylpolyglutamate synhase (FPGS) and gamma-glutamyl hydrolase (GGH) dynamically determine the intracellular concentrations of methotrexate(MTX) and its active metabolites, methotrexate polyglutamates (MTXPG), in ALL cells, is the key determinant of its antileukemic effects. To investigate whether the expressions ofFPGS,GGHand the ratio ofFPGStoGGHgene expression between pediatric patients with ALL and the normal control children are different, and if they are correlated with chemotherapeutic efficacy of MTX in ALL patients. Methods The children newly diagnosed with ALL at Shenzhen Children's Hospital were recruited as ALL group, children with nonmalignancy as the control group. Bone marrow samples from ALL group and peripheral blood samples from the control group were analyzed for the expressions ofFPGSandGGHgenes by SYBR Green relative quantitative real-time PCR. The difference ofFPGSandGGHgene expressions was compared between ALL group and the control group. The subjects were divided into high- and low-expression subgroups according to the median ofFPGSandGGHexpression level，the discrepancies of MTX effect, toxicity and prognosis were analyzed by different expression subgroups ofFPGSandGGH.ResultsSixty-one children with newly diagnosed ALL at mean age 4.6 years were enrolled in this study, including 39 males and 22 females; thirty children averagely aged 4.2 years were enrolled in the control group, including 19 males and 11 females. The median (P25-P75) expressions ofFPGS,GGHand the ratio ofFPGStoGGHgene expression in ALL group(FPGS/β-actin,GGH/β-actin,FPGS/GGH)were 14.14(6.52,27.31)，9.34(4.97,14.22) and 1.74(0.76,2.91), significantly higher than 0.59(0.35-1.23)，3.00(0.94-5.26) and 0.26(0.13-1.00) in the normal group(P<0.01). The recurrence rate was 3.7% (1/27) in the subjects with higherFPGSgene expression verse 23.3% in those with lower gene expressions (P<0.05). High expression ofFPGSgene was correlated with higher risk of neutropenia(OR=4.167，95%CI：1.65-10.52，P=0.003). High expression ofGGHincreased the risk of hepatotoxicity(OR=5.61，95%CI =1.14-27.47，P=0.033). No correlation was found between the ratio ofFPGStoGGHgene expression and chemotherapeutic effect, toxicity of MTX in this study.ConclusionThe expressions ofFPGS,GGHand the ratio ofFPGStoGGHgene expression in ALL children were higher than that in the control children. Expression ofFPGSgene is associated with chemotherapeutic effect, toxicity of MTX in ALL children.

Folypolyglutamate synthetase； Gamma-glutamyl hydrolase； Gene expression； Acute lymphoblastic leukemia； Childhood

深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目：JCYJ20130401114111456；深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)技術(shù)創(chuàng)新計(jì)劃：CXZZ20130320172336579

廣東省深圳市兒童醫(yī)院 1 血液科，2 兒科研究所 深圳，518038

文飛球，E-mail:fwen62@126.com; 陳小文，E-mail:cxwbrian@aliyun.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2014.06.007

2014-10-17

2014-12-02)