負(fù)荷劑量氟伐他汀對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用——模擬缺血預(yù)適應(yīng)

侯倩 王園園 趙志芳 胡海娟 崔煒

目前，搶救急性心肌梗死后瀕死心肌的唯一有效方法是盡快實(shí)現(xiàn)再灌注，但缺血再灌注損傷(IRI)嚴(yán)重阻礙缺血心肌的功能恢復(fù)。缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)及藥物預(yù)適應(yīng)(PPC)對心肌IRI 均存在第二窗口保護(hù)作用且機(jī)制相似，而PPC 的可行性強(qiáng)、安全性更高。他汀類藥物的多效性作用使其應(yīng)用范圍逐步擴(kuò)大，包括減少心肌IRI，其中負(fù)荷量給藥及藥物親水性差異是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵［1-5］。目前，負(fù)荷劑量他汀對心肌IRI 保護(hù)作用是否具有經(jīng)典PPC 的雙時間窗及其與IPC 的比較少有報道。本研究選取兼有親水性及親脂性的氟伐他汀，探討負(fù)荷量預(yù)處理給藥對大鼠在體心肌IRI 的實(shí)效性保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用他汀類藥物減輕心肌IRI 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)動物與分組:84 只SD 大鼠［250 ～300 g，(11±1)周齡］隨機(jī)分為12 組(n=7):假手術(shù)組(Sham組)、氟伐他汀預(yù)處理1 h 組(F-1 組)、氟伐他汀預(yù)處理2 h 組(F-2 組)、氟伐他汀預(yù)處理4 h 組(F-3組)、氟伐他汀預(yù)處理6 h 組(F-4 組)、氟伐他汀預(yù)處理12 h 組(F-5 組)、氟伐他汀預(yù)處理24 h 組(F-6 組)、氟伐他汀預(yù)處理48 h 組(F-7 組)、氟伐他汀預(yù)處理72 h 組(F-8組)、缺血再灌注組(I/R 組)、缺血預(yù)適應(yīng)第一窗口組(IPC-1 組)及缺血預(yù)適應(yīng)第二窗口組(IPC-2 組)。將氟伐他汀鈉膠囊溶于生理鹽水(20 mg/ml)，F(xiàn)-1 ～F-8組分別于冠狀動脈缺血前1、2、4、6、12、24、48 和72 h 灌胃氟伐他汀80 mg/kg;Sham 組、I/R 組、IPC-1 組及IPC-2 組灌胃等量生理鹽水。

2. 模型制備:各組大鼠稱重后以2%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖。氣管插管，連接呼吸機(jī)。開胸，在前降支發(fā)出2 ～3 mm 處縫線 穿 刺。關(guān) 胸 平 衡10 min，1 ∶250 U 肝 素(500 U/kg)腹腔注射抗凝。Sham 組不接扎縫線，靜置150 min;采用阻斷前降支30 min，復(fù)灌120 min 的方法制備大鼠心肌缺血再灌注模型;采用阻斷前降支5 min，復(fù)灌5 min，循環(huán)3 周期，其后或24 h 后再次阻斷30 min，復(fù)灌120 min 的方法制備大鼠心肌IPC 模型及延遲IPC 模型。心肌顏色恢復(fù)，心電圖ST 段回落50%以上視為再灌注成功。實(shí)驗(yàn)期間發(fā)生頑固性心室顫動、心搏驟停或結(jié)扎線脫出的大鼠予以剔除。

3. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集與處理:復(fù)灌期間心律失常情況依據(jù)Lambeth 原則［6］記錄，Curtis-Walker 法［7］評分。復(fù)灌結(jié)束，經(jīng)肺動脈采血1 ml，離心取血清，用光化學(xué)法測定血清乳酸脫氫酶(LDH)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性;各組隨機(jī)抽取1 只取大鼠左心室缺血中心區(qū)組織4 塊，用于電鏡觀察;余阻斷血流，右心室注射2% 伊文藍(lán)1 ml，剪取左心室。－20℃冷凍20 min 塑形，垂直心臟長軸切片(厚度1 mm)并拍照。于1%氯化三苯基四氮唑(TTC)液中37℃避光孵育15 min，再次拍照。用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0 測算梗死區(qū)、缺血區(qū)及正常區(qū)面積，然后按區(qū)分離心肌，稱重記錄。缺血程度用心肌缺血區(qū)重量/左心室重量(IZ/LVg)及缺血區(qū)面積/左心室面積(IZ/LVs)表示;心肌梗死程度用心肌梗死區(qū)重量/缺血區(qū)重量(IN/IZg)及心肌梗死區(qū)面積/缺血區(qū)面積(IN/IZs)表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用盲法處理，由兩位實(shí)驗(yàn)員分別計算，取均值進(jìn)行統(tǒng)計。

4. 統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x ±s)表示。資料采用重復(fù)測量方差分析檢驗(yàn)，拒絕球檢驗(yàn);組間比較采用配對t 檢驗(yàn);不同處理組間比較采用單因素方差分析LSD 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 負(fù)荷量氟伐他汀預(yù)處理對心肌IRI 的影響

(1)心肌梗死面積:拒絕球性假設(shè)，F(xiàn)-1 ～F-8 組與I/R 組相比，大鼠心肌梗死面積均值在不同時間點(diǎn)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。預(yù)處理與時間點(diǎn)有交互作用，即大鼠心肌梗死面積均值在預(yù)處理不同時間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。與I/R 組相比，除F-5、F-6 組外，余各組心肌梗死面積顯著減少(P ＜0.05)，其中F-3 組較F-1、F-5、F-6、F-7、F-8 組心肌梗死面積顯著減少(P ＜0.05)，較F-2、F-4 組有減少趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。F-7 組較F-5、F-6 組心肌梗死面積顯著減少(P ＜0.05);較F-8 組有減少趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)(表1)。

表1 各組缺血再灌注后心肌缺血及梗死程度的情況

(2)心肌微結(jié)構(gòu)改變:光鏡下，Sham 組心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，心肌纖維致密，排列整齊;I/R 組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、水腫，心肌纖維大片扭曲、斷裂壞死，炎癥細(xì)胞浸潤顯著。F-7 組心肌細(xì)胞受損較F-3 組顯著，但兩者均較I/R 組顯著改善，即局部心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，心肌纖維部分?jǐn)嗔?，偶有炎?xì)胞浸潤(圖1)。

圖1 各組心肌染色情況(HE 染色，×1000)

透射電鏡下，Sham 組肌原纖維排列整齊，線粒體多而密集，嵴突及糖原顆粒豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無擴(kuò)張;I/R 組肌纖維重度水腫，結(jié)構(gòu)紊亂，肌絲斷裂，線粒體腫脹明顯，嵴斷裂，糖原顆粒減少;F-3 組線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，密集分布，嵴突數(shù)目較多，糖原顆粒較豐富;F-7 組心肌細(xì)胞受損較F-3 組顯著，即胞質(zhì)較稀疏，肌原纖維攣縮，但兩者均較I/R 組有顯著改善(圖2)。

(3)其他指標(biāo):與心肌梗死面積變化趨勢相似，氟伐他汀對心肌梗死質(zhì)量及缺血程度、血清LDH 及CK-MB 活性、心律失常評分等指標(biāo)的保護(hù)作用同樣在F-3 組(4 h)及F-7 組(48 h)出現(xiàn)兩個高峰(表2)。故負(fù)荷劑量氟伐他汀對心肌IRI 的保護(hù)作用呈現(xiàn)兩個窗口，F(xiàn)-3、F-7 組為起保護(hù)作用的最佳組，擇其與IPC 組進(jìn)行下一步比較。

2. 負(fù)荷劑量氟伐他汀預(yù)處理與IPC 對心肌IRI的影響

(1)與IPC 第一時間窗口保護(hù)效果比較:與I/R組相比，F(xiàn)-3、F-7 及IPC 各組的心肌缺血及心肌梗死程度減輕(表1);血清LDH、CK-MB 顯著降低，心律失常評分顯著減小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P 均＜0.05，表2)。與IPC-1 組相比，F(xiàn)-3、F-7 組心肌缺血及心肌梗死程度增強(qiáng)(表1);血清LDH、CK-MB 顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);心律失常評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)(表2)。透射電鏡下可見F-3、IPC-1 組心肌細(xì)胞受損程度相近，F(xiàn)-7 組心肌細(xì)胞受損程度較重，但均較I/R 組顯著減輕(圖2)。

(2)與IPC 第二時間窗口保護(hù)效果比較:與IPC-2組相比，F(xiàn)-3 組的心肌缺血及梗死程度減輕(表1);血清CK-MB 顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P 均＜0.05)，其他指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)(表2);與IPC-2 組相比，F(xiàn)-7 組梗死面積有減少趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)(圖2);心肌梗死質(zhì)量顯著降低(P ＜0.05);缺血程度顯著增強(qiáng)(P ＜0.05);其他指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)(表1);透射電鏡下可見F-7、IPC-2 組心肌細(xì)胞受損程度相近，較I/R 組減輕，但不及F-3、IPC-1 組(圖2)。

圖2 透射電鏡下各組心肌形態(tài)(×12 000)

表2 各組缺血再灌注后血清LDH、CK-MB 活性及心律失常評分情況

討 論

1986 年，Murry 等［8］發(fā)現(xiàn)反復(fù)遭受短暫缺血的心肌，可耐受隨后較長時間缺血造成的損傷，并命名為心肌IPC。研究發(fā)現(xiàn)，IPC 及應(yīng)用藥物模擬IPC 的PPC 對心肌IRI 均存在保護(hù)作用，且呈現(xiàn)兩個窗口:第一窗口作用強(qiáng)大但短暫，可顯著減輕心肌梗死程度;第二窗口于24 h 后發(fā)生，作用稍弱，持續(xù)3 ～4 d，除減輕心肌梗死程度，還可長時間穩(wěn)定對抗心肌頓抑。因此，第二窗口保護(hù)具有更大的臨床意義［9］。近期有學(xué)者提出缺血后適應(yīng)概念，但臨床應(yīng)用IPC 及缺血后適應(yīng)均涉及同一部位、多次球囊刺激，顯著增加機(jī)械性破壞血管床的風(fēng)險，因而難以在臨床推廣。相比之下，PPC 操作簡單，收益大且并發(fā)癥少。故10 年前Parratt 等［10］就提出PPC 逐步取代IPC 是一種必然。

他汀類藥物可通過活化磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性，激活蛋白激酶C(PKC)抗心肌IRI，該過程在離體人內(nèi)皮細(xì)胞中所需時間小于1 h［11］，這與預(yù)適應(yīng)第一窗口保護(hù)機(jī)制相似。但該過程中，環(huán)氧化酶-2(COX-2)表達(dá)上調(diào)為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)所依賴，而IPC 則不同［12-13］。說明了雖然他汀預(yù)處理與IPC 存在相同或相似通路，但I(xiàn)PC 的刺激更強(qiáng)大，能激活公共通路以外的通路，迅速發(fā)揮作用。本研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，即負(fù)荷劑量氟伐他汀預(yù)處理顯現(xiàn)顯著的第一窗口保護(hù)(1 h 內(nèi)出現(xiàn)，4 h 達(dá)峰，持續(xù)5 h)，如顯著減少心肌缺血、減輕壞死程度、減少心律失常評分、降低心肌損傷標(biāo)記物水平及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的破壞，且該作用在減少心肌缺血、壞死程度方面強(qiáng)于IPC 第二窗口保護(hù)。因此，相比之下，IPC 第一窗口保護(hù)發(fā)揮了更強(qiáng)大的作用。

預(yù)適應(yīng)第二窗口保護(hù)機(jī)制較為復(fù)雜，主要通過由缺血事件促生的一氧化氮(NO)、活性氧及腺苷等，激活PKC、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子并募集多種酶類，介導(dǎo)諸如一氧化氮合酶(NOS)、COX-2 及心臟保護(hù)蛋白的合成而發(fā)揮作用［14-15］。他汀類藥物多效性的作用機(jī)制與其存在共同通路，因此，負(fù)荷劑量氟伐他汀預(yù)處理第二窗口保護(hù)的時程與IPC 相似(24 h 后出現(xiàn)，48 h 達(dá)峰，持續(xù)24 h 以上)，且在減少心肌缺血、心律失常評分、血清心肌損傷標(biāo)志物水平等方面與IPC 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義［16］。另外，他汀可顯著增加存在eNOS 缺陷的缺血再灌注小鼠后COX-2 的表達(dá)，但I(xiàn)PC 不能，說明他汀類藥物存在獨(dú)立于IPC 的抗凋亡機(jī)制［17］。這與本研究中負(fù)荷劑量氟伐他汀對心肌IRI 第二窗口保護(hù)比IPC 強(qiáng)為類似趨勢。

臨床上，IPC 第二窗口保護(hù)可長時間穩(wěn)定發(fā)揮抗心肌頓抑及抗心絞痛的作用，但本研究樣本量較少且僅觀察了氟伐他汀，未涉及負(fù)荷劑量他汀的藥物安全性及具體心肌保護(hù)機(jī)制。因此，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)前負(fù)荷劑量服用氟伐他汀是否可通過模擬IPC 減輕心肌IRI，提高患者預(yù)后及生存率，仍需更大規(guī)模實(shí)驗(yàn)研究及臨床驗(yàn)證。

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