新生大鼠高膽紅素血癥及腦病模型的建立與評價*

王曉麗， 郭明星， 梁俊暉， 張常娥

(廣州醫(yī)科大學病理生理學教研室， 廣東 廣州 510182)

新生兒高膽紅素血癥是由膽紅素產生增加或排泄減少所致，其臨床主要癥狀是黃疸[1]。新生兒黃疸發(fā)生率為80%[1],其中發(fā)生在出生后0～6 d的占64%[2]。膽紅素腦病指新生兒出生1周內，血清中膽紅素的濃度升高所致的急性腦損傷[3]。膽紅素的毒性作用導致永久性的腦損傷稱之為核黃疸，其死亡率為10%，并且存活的70%患兒留有神經系統(tǒng)后遺癥[4]。膽紅素腦病對家庭和社會都造成了巨大的負擔[5]，因發(fā)病機制仍未闡明，臨床上也無特效的治療措施，故膽紅素介導的神經系統(tǒng)損害仍是研究的熱點。膽紅素腦病研究的疾病模型有很多種，包括先天基因缺失型，后天代謝損傷型等，但各自研究的側重點不同，目前尚無統(tǒng)一的疾病研究模型。本文以3 d齡SD新生大鼠為研究對象，利用新生鼠血腦屏障不完善[6]的特點，腹腔注射膽紅素，制作一種既不改變基因型，又不改變體內正常物質代謝的高膽紅素血癥新生大鼠，并對其進行相關指標測定和評價，以期為該領域的研究建立和確定穩(wěn)定的高膽紅素血癥及膽紅素腦病動物模型。

材 料 和 方 法

1 動物與材料

1.1動物 3 d齡新生SD大鼠，SPF級，體重(7.79 ±0.74)g，由廣東省實驗動物中心提供。合格證號為44007200000384/440720929，在室溫環(huán)境和50%濕度[7]的條件下，新生鼠避光、母鼠哺育。

1.2藥品及試劑 膽紅素購自Sigma，血清總膽紅素測試盒購自南京建成生物工程研究所，DC蛋白定量試劑盒購自Bio-Rad，ATP檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所，其余生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.3主要儀器 電子天平(Denver instrument)，照相機(SAMSUNG)，勻漿器(FLOKO)，離心機(Eppendorf 5810R)，多功能全波長酶標儀(Thermo)，振蕩切片機(Leica2000)，顯微鏡(Olympus BX51)。

2 方法

2.1膽紅素的配制 避光稱取晶體膽紅素66.7 mg，溶于1 mL 0.5 mol/L NaOH中，加入雙蒸水9 mL，用0.5 mol/L HCl 調節(jié)pH至8.5，濃度為6.67 g/L。

2.2膽紅素腦病動物模型的建立[8]將新生SD大鼠按窩別和體重隨機均分為7組：腹腔注射生理鹽水(Con 組)，以及膽紅素6.25 μg/g組(T1 組)、12.5 μg/g組(T2 組)、25 μg/g組(T3 組)、50 μg/g組(T4 組)、100 μg/g組(T5 組)和200 μg/g組(T6 組)，每天2次，共注射6次，室溫環(huán)境下避光哺育，第1次注射前(0 h)及末次注射12 h后(72 h)拍照、稱重并取材。

2.3測定指標

2.3.1動物一般情況 每次注射膽紅素及取材前，觀察新生鼠一般情況，包括：皮膚顏色、精神狀態(tài)、吃奶情況、呼吸、運動、對外界的刺激反應等，并稱重。記錄死亡新生鼠的數(shù)量，并計算生存率和死亡率，停止注射后再延續(xù)觀察記錄1周。

2.3.2血清總膽紅素濃度和游離膽紅素濃度 新生鼠末次注射12 h后，斷頭取血， 4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清暫時避光儲存于-20 ℃ 冰箱備用。用重氮化反應法，用酶標儀在600 nm波長處，分別測定血清總膽紅素及結合膽紅素的吸光度(A)值，根據標準曲線[9]計算出血清總膽紅素和游離膽紅素的濃度，具體操作步驟按試盒說明書進行。

2.3.3胃內容物重量及其指數(shù) 新生鼠斷頭后，將鼠尸體置于冰上片刻，待胃內容物冷卻凝固，取出全胃，去除胃表面系膜后，稱胃全重。沿胃小彎縱向剪開，將胃內容物擠出，觀察胃內容物顏色并稱胃濕重，計算胃內容物重量(胃全重-胃濕重)及胃內容物指數(shù)(胃內容物重量/胃濕重)。

2.3.4肝/體重百分比 末次注射膽紅素12 h后，新生鼠稱重，斷頭，剖開腹腔，分離肝臟，去除血管蒂、表面系膜等，觀察肝臟結構及顏色，稱肝重，并計算肝/體重百分比(肝重/體重×100%)。

2.3.5腦組織膽紅素的含量 新生鼠斷頭后，用眼科剪將顱骨從枕骨大孔開始，沿矢狀縫向前剪開，并充分暴露大腦，彎鑷將大腦前極輕輕翻開，夾斷視神經交叉，取出全腦，4 ℃生理鹽水漂洗，濾紙去血跡吸干，用氯仿微量抽提腦組織中的膽紅素，重氮化反應法[10]進行測定。在570 nm波長處，測定腦組織膽紅素的A值，同時制作標準曲線，并計算腦組織膽紅素含量。

2.3.6腦組織ATP的含量 新生鼠斷頭后取出腦組織，用ATP試劑盒的裂解液將腦組織制成10%的組織勻漿， 4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清檢測ATP濃度，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。用Lowry 法定量腦組織蛋白質的含量，并計算腦組織ATP的含量。

2.3.7腦組織的含水量 新生鼠斷頭后取出腦組織稱腦濕重后，將腦放于62 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中，待其恒重后稱干重，計算腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

2.3.8腦組織形態(tài)學檢測 新生鼠末次注射12 h后，將大鼠麻醉，開胸開腹，充分暴露心臟及肝臟，去除心包膜，用眼科剪將肝臟剪破，將事先改造好的注射器針頭，由左心室心尖部小心刺入心腔，順著主動脈走行方向將彎針頭小心地插入主動脈。用預熱37 ℃肝素生理鹽水灌流，待肝臟流出清亮液體1 min左右停止，共灌注大約10 mL； 再用4%多聚甲醛溶液灌流。停止灌流后，斷頭，將大鼠腦組織輕輕取出，于10%多聚甲醛中進行后固定約24 h。振蕩切片機連續(xù)切片，厚度為20 μm。常規(guī)乙醇梯度脫水，蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色及尼氏染色(Nissl staining)，透明、封片，光鏡下觀察組織病理改變。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，對于隨機區(qū)組設計資料，方差齊，則多重比較采用Bonferroni法，其中重復測量數(shù)據首先進行相關性分析，如果相關則采用多元方差分析；如果不相關則采用重復測量設計資料的單變量方差分析；方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗的多重比較Bonferroni法。采用SPSS 13.0 統(tǒng)計學軟件處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 一般情況、皮膚顏色和體重

1.1一般情況 所有的新生鼠經過3 d不同濃度的膽紅素注射處理后，Con和T1組皮膚顏色紅潤，彈性好，活動正常；T2和T3 組皮膚出現(xiàn)輕度黃染，彈性一般，T2 組可見輕度精神萎靡、肌張力減低，T3 組活動減少，允吸不佳，有肌張力降低所致的輕度翻滾和俯伏癥狀出現(xiàn)；T4組皮膚中度黃染，彈性差，活動顯著減少；T5組皮膚重度黃染，甚至發(fā)綠，皮膚彈性極差，吃奶次數(shù)明顯減少，對外界刺激的反應明顯減弱，甚至不活動；T6組皮膚呈現(xiàn)黃綠色，色澤晦暗，拒奶，隨著注射次數(shù)的增加出現(xiàn)呼吸減慢，甚至昏迷，末次注射12 h后，基本全部死亡，故后續(xù)實驗未設置T6組,見圖1。

Figure 1. The skin color of neonatal rats at the time points of 0 h(A) and 72 h (B) after the first injection．

1.2新生鼠體重 為了消除不同窩別新生鼠的體重差異對實驗結果的影響，我們按窩別隨機區(qū)組分配，每組12只，每次注射膽紅素前稱重。隨著注射次數(shù)的增多，Con和T1組新生鼠體重也隨之增加，2組間無顯著差異(P>0.05)；T3 組在注射6次后(72 h)、T4 組在5 次注射后(60 h)、T5和T6組注射2次后(24 h)，新生鼠體重與Con 組相比有顯著差異(P<0.05)； T5 組新生鼠從注射開始到結束體重無增長。T6 組注射2次后，體重增長開始抑制，隨著注射次數(shù)增加，呈負增長，與Con和T1組相比，體重差異顯著(P<0.01)，見圖2。

Figure 2. The changes of body weight of rats at different time points．Mean ±SD.n=12.*P<0.05, **P<0.01 vs Con; #P<0.05, ##P<0.01 vs T1; $P<0.05 vs T2．

2 新生鼠生存率的比較

新生大鼠經過3 d膽紅素注射后，對參與實驗的部分存活大鼠進行統(tǒng)計和拍照，并計算大鼠生存率。Con、T1和T2 組生存率分別為100%、100%和97.62%，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。T3 組生存率為86.57%，T4 組65.00%，T5 組46.15%，T6 組2.70%。與Con和T1 組相比，T3 組生存率顯著降低(P<0.05)，T4和T5 組分別與其它任意組相比，生存率均有顯著差異(P<0.01)，且依次遞減。經過6 次注射，T6組死亡率接近100%，出于實驗可行性及統(tǒng)計學的考慮，不參與其它指標的比較。停止膽紅素注射后，繼續(xù)觀察和記錄，1周后，T2 和T3組大鼠的生存率分別維持在 97.6%和86.5%，沒有進一步的大鼠死亡；而T4組為53.2%，T5組為10.1%。T4和T5組1周后的死亡率與其它各組比較差異有統(tǒng)計學意義，見圖3。

3 胃內容物重量及胃內容物指數(shù)

經過3 d膽紅素注射后，72 h處死新生鼠，取全胃稱重，清除胃內容物后稱胃濕重，計算出胃內容物的重量。觀察發(fā)現(xiàn)：Con、T1、T2和T3組胃內容物呈乳白色，T4 組呈黃色，T5 組呈黃綠色。隨著膽紅素注射濃度的加大，新生鼠進食的奶量明顯減少，與Con和T1組比，T3、T4 和T5組胃內容物重量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見表1。

隨著膽紅素注射劑量和次數(shù)的增加，胃內容物指數(shù)整體呈現(xiàn)降低趨勢。與Con和T1組相比，T2～T5 組胃內容物指數(shù)顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與T2和T3 組相比，T5 組胃內容物指數(shù)顯著降低(P<0.05)，見表1。

4 肝/體重百分比

新生鼠膽紅素末次注射72 h后，剖腹取肝，稱肝重，并切開肝臟觀察。 Con、T1、T2和T3 組肝臟色澤紅潤，結構完整，T4 組色澤黃染，結構尚完整，T5 組色澤暗黃，結構不完整。與Con和T1 組相比， T5 組肝/體重百分比顯著升高(P<0.05)，見表1。

Figure 3. The survival rate of rats in each group at different time points.

表1 新生鼠胃內容物重量、胃內容物指數(shù)及肝/體重百分比

5 血清總膽紅素和游離膽紅素的濃度

新生鼠膽紅素注射72 h后，處死，取血清檢測總膽紅素和結合膽紅素含量，并計算游離膽紅素的量。與Con 組相比，T1 組血清總膽紅素和游離膽紅素的含量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，T2～T5 組顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與T2、T3和T4 組相比，T5 組血清總膽紅素和游離膽紅素增高(P<0.01)，見表2。

6 腦組織膽紅素含量

末次注射膽紅素72 h后，取出新生鼠腦組織觀察，可見T3 組大腦皮層和腦干出現(xiàn)輕度黃染，T4和T5 組大腦皮層、小腦和腦干出現(xiàn)明顯的黃染，但均無明顯的出血灶。腦組織勻漿后測定膽紅素含量，結果顯示：與Con 組相比，T3、T4和T5組腦組織膽紅素含量顯著增高(P<0.05 或P<0.01)；與T2和T3 組相比，T4和T5組顯著升高(P<0.05 或P<0.01)，見表 2。

表2 新生鼠血清總膽紅素、游離膽紅素濃度和腦組織膽紅素含量

7 腦組織ATP含量

取新生鼠腦組織勻漿液，測定ATP的含量。隨著注射膽紅素濃度的增加，腦組織中ATP的含量增加，T3 組達到最高峰，隨后T4和T5 組ATP濃度下降，呈現(xiàn)拋物線式。與Con 組相比，T1、T2和T3組差別無統(tǒng)計學意義，T4和T5組則顯著降低(P<0.05 或P<0.01)，見表 3。

8 腦組織含水量

新生鼠經過6 次注射膽紅素后，72 h取出腦組織，稱腦重，經過62 ℃烘烤，待恒重后，稱腦組織干重，計算各組新生鼠腦組織含水量，比較發(fā)現(xiàn)各組之間均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 腦組織ATP含量和腦含水量

9 HE染色

對新生鼠進行72 h膽紅素腹腔注射后，灌流固定，振蕩切片，進行HE染色。光鏡下可見：Con組大鼠腦皮質神經元結構清晰完整，細胞排列密集整齊，神經元胞漿豐富淡染，細胞核居中，核仁清楚，細胞漿紅染，細胞周圍間隙致密沒有水腫。隨著膽紅素濃度的升高，大腦皮層不同部位神經元數(shù)量逐漸減少。T4和T5組，神經元結構紊亂，可見細胞腫脹，核固縮、碎裂、溶解等，部分細胞呈嗜酸性變，腦組織膽紅素沉積逐漸增多，可見黃染顆粒。大腦皮層可見部分神經元核染色質濃縮，染色加深，甚至核碎裂等現(xiàn)象，推測為凋亡細胞。部分神經元呈均質紅染的無結構物質，核染色消失，推測為壞死的細胞，見圖4。

10 尼氏染色

末次膽紅素注射12 h，灌流固定后取材，振蕩切片，進行尼氏染色。普通光鏡下，紫色為尼氏小體，皮質神經元的結果顯示：隨著膽紅素濃度的增高，皮質神經元胞體變小，尼氏小體減少，胞質染色逐漸變淺，T5組部分神經元溶解甚至消失，見圖5。

Figure 4. HE staining of cortical neurons in the rats with bilirubin encephalopathy. A: scale bar=50 μm; B: scale bar=20 μm.

Figure 5. Nissl staining of cortical neurons in the rats with bilirubin encephalopathy.A：scale bar=50 μm; B：scale bar=20 μm.

討 論

高膽紅素血癥是新生兒常見的病理過程，主要臨床表現(xiàn)是皮膚和黏膜黃染，臨床發(fā)病率極高。高膽紅素血癥的程度及持續(xù)時間與膽紅素腦病的嚴重程度有關，重者可以出現(xiàn)膽紅素腦病或留有永久性神經系統(tǒng)后遺癥，因其確切的發(fā)病機理未完全明了，目前尚無有效的治療藥物，故死亡率高。為了更好地研究疾病的發(fā)生機制，尋找有效的治療方法和藥物，亟需建立一種穩(wěn)定而有效的動物模型。

目前用于研究高膽紅素血癥的動物模型品種繁多，包括：(1)膽紅素大劑量一次性靜脈注射：雖然能成功地復制高膽紅素血癥模型，病理檢查腦干中可見膽紅素結晶[11-12]，但這種造模方法操作難度相對較大，應用于新生鼠有其局限性，但成年大鼠一次性靜脈注射需另外加藥物使血腦屏障開放，因而增加了造模過程中其它因素的干擾，更關鍵的是其與新生兒黃疸發(fā)病的時間窗及大腦神經元的發(fā)育水平不一致，不利于模擬新生兒核黃疸發(fā)病及其對個體長遠影響的研究。(2)基因突變(缺陷)模型： 純合子Gunn大鼠因編碼葡萄糖醛酸轉移酶的基因缺陷，新生鼠體內游離的膽紅素不能轉化成結合型膽紅素被排泄而出現(xiàn)黃疸，但血液中膽紅素的濃度達不到核黃疸的程度[13]，需要用藥物抑制膽紅素與白蛋白結合[14]，或破壞紅細胞[15]來提高血液中的膽紅素濃度。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1(UDP bilirubin glucuronosyl transferase 1A1，UGT1A1) 是調控人類膽紅素代謝的關鍵肝酶[13]，新生幼鼠UGT基因突變后體內的膽紅素濃度高且穩(wěn)定，是復制人類先天高膽紅素血癥的理想模型，但因為存在基因改變的特性，可能會對新生鼠造成一些潛在的影響，同時基因突變所導致的可重復性差也是一大難題。(3)溶血性模型：用藥物破壞紅細胞，可以成功制作溶血性高膽紅素血癥動物模型[16]，也可以誘導核黃疸，適用于膽紅素腦病的研究，但這類藥物除損傷紅細胞外，也可致白細胞減少，損傷動物的免疫功能。綜合起來，各種模型均有利弊，且適合研究的側重點不同，不利于全面整體的研究。

為了更有利于基礎及臨床研究，我們參考安麗等[8]方法，利用新生鼠血腦屏障發(fā)育不完善的特點，在7d齡新生鼠一次性腹腔注射的基礎上進行改進。首次以3 日 齡SD新生鼠為對象，進行膽紅素連續(xù)6次注射，使其血液膽紅素的升高非一過性而是維持一定時間，從而建立一種持續(xù)穩(wěn)定的高膽紅素血癥模型。

通過本研究發(fā)現(xiàn)：新生大鼠經過膽紅素注射后，隨著膽紅素注射次數(shù)及濃度的增多，大鼠血清和腦組織中游離膽紅素的含量逐漸升高。一般表現(xiàn)為食欲逐漸降低，吃奶量減少，且大鼠活動能力受抑制；體重也逐漸被抑制，到200 μg/g(T6組)劑量時，體重出現(xiàn)負增長，72 h死亡率接近100%，3 d后停止膽紅素注射，繼續(xù)對幸存的新生鼠觀察和記錄1周后發(fā)現(xiàn)，膽紅素對新生鼠的影響依然存在，T4和T5組新生鼠因出現(xiàn)高膽紅素血癥，死亡率隨著時間的延長而繼續(xù)增加，1周后死亡率分別為46.8%和89.9%，其余各組死亡率幾乎沒變化。同時，濃度越大，皮膚、黏膜和腦組織黃染的程度越嚴重。并且隨著膽紅素注射量的升高，肝臟受損傷的程度也加重，但各組新生鼠腦組織的含水量沒有顯著差異。腦組織的ATP含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在濃度為25 μg/g(T3組)時，ATP 的含量達到最高值。有文獻表明[17]，在神經細胞進行抗損傷過程中，初期的能量代謝是一個代償過程， 表現(xiàn)為ATP的含量增加，當損傷達到一定程度時，神經元細胞能量代謝呈現(xiàn)失代償反應，表現(xiàn)為ATP含量降低。另有文獻報道[18]，在體外進行神經元單獨培養(yǎng)時，其抗損傷能力相對較差，膽紅素作用后，ATP含量只會降低，而在神經元與膠質細胞共培養(yǎng)，加藥4 h檢測時，發(fā)現(xiàn)ATP的含量會增高達到峰值，隨著藥物損傷的加重，ATP的含量才會降低，研究者認為，這是高膽紅素血癥能量代謝增強的佐證，我們的檢測結果與其相似。新生鼠作為一個具有完整功能的機體，各種神經細胞之間相互作用、相互協(xié)調，在輕度高膽紅素血癥時，能量代謝代償性增強，ATP含量會有所增高。嚴重高膽紅素血癥和核黃疸時，線粒體損傷嚴重，細胞能量代謝嚴重障礙，ATP含量也隨之降低，有關能量代謝雙向變化的具體機制，有待進一步研究。從腦組織切片HE及尼氏染色發(fā)現(xiàn)，隨著膽紅素注射劑量的增加，各組大鼠大腦皮層及海馬等不同部位神經元數(shù)量減少逐漸明顯，結構紊亂，可見細胞腫脹，核固縮、碎裂、溶解等，部分細胞呈嗜酸性變，腦組織膽紅素沉積的顆粒逐漸增多，神經元存在不同程度的凋亡與壞死。隨著膽紅素注射劑量的增加，神經元內尼氏小體染色亦逐漸變淺，小體數(shù)量明顯減少，部分溶解甚至消失，說明各實驗組神經元受到不同程度的損害。

從我們的實驗結果和觀察到的現(xiàn)象可以確定，3日齡新生鼠經腹腔注射膽紅素12.5、25、50和100 μg/g均可以成功建立高膽紅素血癥模型，鑒于各組間腦組織ATP含量、HE及尼氏染色等的變化差異，我們認為50和100 μg/g劑量可以成功復制出膽紅素腦病的模型，因 100 μg/g 后續(xù)死亡率增加，50 μg/g造模更穩(wěn)定和全面，更適合高膽紅素血癥、膽紅素腦病及其后遺癥的長時間研究。

膽紅素是親脂性的，血漿游離膽紅素濃度升高，透過血腦屏障進入大腦，致腦組織損傷，產生膽紅素腦病，這與新生兒期發(fā)生高膽紅素血癥和核黃疸發(fā)病的時間窗及條件相似，可以更精確地模擬早產兒黃疸的發(fā)病過程；同時我們多層次、多角度的對該模型進行了測定、觀察和評價，成功復制出高膽紅素血癥和膽紅素腦病的新生大鼠模型，為該領域的后續(xù)研究建立了穩(wěn)定的研究模型和具體的研究方法。我們采用腹腔注射膽紅素的方式造模，操作難度小，經濟易行，不存在因基因型改變所造成的潛在影響，還避免了藥物或化學物質注射引起的干擾。通過不同濃度膽紅素的注射，還可以靈活控制血液膽紅素的濃度，可以達到不同的研究目的。該模型的確定對高膽紅素血癥，膽紅素腦病及其后遺癥的研究具有一定的理論和現(xiàn)實意義。

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