四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化早期大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜形態(tài)改變的動(dòng)態(tài)研究*

黃月紅， 郭杞蘭， 陳治新， 陳運(yùn)新， 張莉娟， 王小眾

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，福建 福州 350001)

肝竇是肝細(xì)胞與血漿之間進(jìn)行物質(zhì)交換的場(chǎng)所。 肝竇壁由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothe-lial cells, LSECs)組成。生理狀態(tài)下LSECs遠(yuǎn)側(cè)胞質(zhì)有許多窗孔，呈篩狀形態(tài),內(nèi)皮下無(wú)基底膜(basement membrane, BM)[1]。病理狀態(tài)下，LSECs的窗孔減少或消失(失窗孔)，內(nèi)皮下 BM形成，形似連續(xù)毛細(xì)血管，稱為肝竇毛細(xì)血管化[2]。肝竇毛細(xì)血管化是肝纖維化過(guò)程中一個(gè)重要的病理改變[3]。研究肝竇毛細(xì)血管化的形成過(guò)程以及其與肝纖維化、肝硬化的發(fā)生關(guān)系已經(jīng)成為肝病研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察LSECs 與肝竇BM在四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)誘導(dǎo)形成大鼠肝纖維化早期的變化，探討四氯化碳誘導(dǎo)大鼠早期肝纖維化時(shí)肝竇毛細(xì)血管化的形成過(guò)程,為進(jìn)一步抗肝纖維化研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物和材料

清潔級(jí)雄性SD大鼠38只，體重(180±20) g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[許可證號(hào)碼為SCXK(滬)2007-0005]，清潔級(jí)條件喂養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵照福建醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例執(zhí)行，并接受倫理委員會(huì)的監(jiān)督和指導(dǎo)。

CCl4和蓖麻油購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，兔抗大鼠CD31 多克隆抗體購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司，兔抗大鼠層黏連蛋白(laminin, LN)及IV型膠原(collagen type IV, Col IV)多克隆抗體購(gòu)自Abcam，枸櫞酸鹽組織抗原修復(fù)液(pH 6.0)、胃蛋白酶消化液、兔超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑及濃縮型DAB試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1大鼠肝纖維化模型建立[4]及實(shí)驗(yàn)分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，苦味酸標(biāo)記，稱體重，平均體重(200±10) g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組(N組，6只)，肝纖維化模型組(M組，32只)。M組大鼠腹腔注射50% CCl4蓖麻油混合液，N組大鼠腹腔注射生理鹽水2 mL/kg，每周2次，共4周，分別于造模第3天、第1周、第2周和第4周，將各組大鼠用10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉(禁食8 h)后，收集各組大鼠肝組織保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2HE染色觀察肝組織病理學(xué)改變 收集各組大鼠左葉肝組織，經(jīng)4%甲醛固定、石蠟包埋，切片常規(guī)脫蠟至水，入蘇木素液染色5 min，自來(lái)水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來(lái)水浸泡15 min或溫水(約50 ℃)5 min，置伊紅液染色2 min，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟組織的炎癥及纖維化程度。

2.3Masson染色法觀察肝組織中網(wǎng)狀纖維的沉積情況 各組大鼠肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，Harris蘇木素液染色1～2 min，蒸餾水洗3次，麗春紅品紅液染色5～10 min，蒸餾水洗3次，磷鉬酸分化1 min至膠原纖維淡紅色，入淺綠液染色，使膠原纖維呈綠色約5～10 min，95%乙醇、無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟組織的網(wǎng)狀纖維沉積情況。

2.4透射電子顯微鏡觀察肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜的改變 取肝左葉部分組織，用鋒利的刀片切成1 mm×1 mm×1 mm, 迅速放入固定液(3%戊二醛-1.5%多聚甲醛)中，4 ℃固定2 h以上，用0.1 mol/L PBS (pH 7.2) 漂洗3次，再用含1%鋨酸和1.5%亞鐵氰化鉀的固定液4 ℃后固定1.5 h，再次漂洗3次，脫水，純618包埋劑35 ℃ 包埋3 h，切片、染色： 超薄切片機(jī)切70～80 nm的超薄切片；經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色5 min，后蒸餾水水洗。在PHILIPS EM208型透射電鏡下觀察肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜的改變并攝片。

2.5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠肝組織中CD31、LN與Col IV的表達(dá) 采用北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司超敏SP免疫組化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。切片常規(guī)脫蠟、水化，枸櫞酸鹽微波或胰蛋白酶抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，Ⅰ抗分別為兔抗大鼠CD31多抗(1∶100)、兔抗大鼠LN多抗(1∶100)和兔抗大鼠Col IV多抗(1∶200)，再加入Ⅱ抗，DAB顯色，蘇木素染液復(fù)染。省略Ⅰ抗和Ⅱ抗作為空白對(duì)照，以PBS替換Ⅰ抗，作為陰性對(duì)照。細(xì)胞漿、核或膜有棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性染色。染色結(jié)果根據(jù)染色細(xì)胞多少及染色深淺判斷各指標(biāo)表達(dá)情況，使用Image-Pro Plus 5.0軟件檢測(cè)各組目的蛋白表達(dá)的積分吸光度(IA)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析，以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

結(jié) 果

1 CCl4誘導(dǎo)肝纖維化早期大鼠肝臟組織病理形態(tài)變化

HE及Masson染色結(jié)果顯示(圖1)，正常對(duì)照組的大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索以肝小葉中央靜脈為中心向四周放射狀整齊排列，肝細(xì)胞無(wú)變性、壞死，肝竇無(wú)擴(kuò)張，少量膠原纖維在匯管區(qū)和中央靜脈分布, 肝小葉間未見(jiàn)纖維組織增生。CCl4造模3 d后大鼠肝小葉中央靜脈及匯管區(qū)血管周圍可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肝細(xì)胞水腫，少數(shù)出現(xiàn)點(diǎn)、灶狀壞死，個(gè)別甚至出現(xiàn)橋接壞死，肝竇略擴(kuò)張,膠原纖維分布同正常組；造模1周時(shí)血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較前減少，仍見(jiàn)少數(shù)點(diǎn)、灶狀壞死及橋接壞死，個(gè)別大鼠肝臟橋接壞死范圍廣，累及多個(gè)小葉，類似重癥肝炎的表現(xiàn)；匯管區(qū)、肝竇擴(kuò)大，纖維組織開(kāi)始增生，沿著匯管區(qū)及中央靜脈向外延伸；造模2周，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較1周時(shí)有所減輕，但纖維組織增生明顯；造模第4周時(shí)，可見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪樣變，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維條索更加粗大明顯，但大部分尚未相互連接，無(wú)完整分界形成。

Figure 1. Pathological changes in the livers (HE and Masson staining, ×200). N：normal control group; M：liver fibrotic model group.

2 CCl4誘導(dǎo)肝纖維化早期大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜的改變

透射電鏡結(jié)果顯示(圖2)，正常對(duì)照組的大鼠LSECs扁平，遠(yuǎn)側(cè)胞質(zhì)成薄片狀、不連續(xù)，有許多窗孔，內(nèi)皮下未見(jiàn)BM，Disse間隙內(nèi)有大量伸入的肝微絨毛，偶有少量膠原纖維，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)含有大量脂滴,呈靜止?fàn)顟B(tài)；CCl4造模3 d后大鼠部分LSECs窗孔數(shù)目減少、直徑變小，內(nèi)皮下未見(jiàn)BM;1周和2周時(shí)，LSECs窗孔進(jìn)一步減少甚至消失，內(nèi)皮下仍未見(jiàn)BM，Disse間隙內(nèi)肝微絨毛減少，HSCs脂滴變少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多；4周時(shí)，LSECs窗孔減少甚至消失，范圍較2周廣，間隔內(nèi)見(jiàn)膠原纖維束，局部?jī)?nèi)皮下可見(jiàn)連續(xù)基底膜。

Figure 2. Fenestration (?) and basement membrane (→) changes of liver sinusoidal endothelial cells in fibrotic rats observed by transmission electron microscopy. N: normal control group; M: liver fibrotic model group.

3 CCl4誘導(dǎo)肝纖維化早期大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31的表達(dá)

SP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31陽(yáng)性染色主要見(jiàn)于中央靜脈及匯管區(qū)血管壁，部分肝竇可見(jiàn)淡染；CCl4模型組大鼠肝竇CD31陽(yáng)性染色區(qū)域及染色程度隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加深。陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度半定量分析顯示造模第3天及1周時(shí)模型組大鼠肝竇CD31陽(yáng)性表達(dá)較正常大鼠明顯增多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而3 d與1周之間肝竇CD31陽(yáng)性表達(dá)沒(méi)有明顯差別(P>0.05)；隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，肝竇CD31陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 CCl4誘導(dǎo)肝纖維化早期大鼠肝組織Col IV的表達(dá)

SP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常組大鼠Col IV陽(yáng)性染色多位于中央靜脈、匯管區(qū)血管、膽管內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜，肝竇壁染色微弱、斷續(xù)；CCl4肝纖維化大鼠肝組織Col IV陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度隨著纖維化程度的加重而增強(qiáng)，陽(yáng)性表達(dá)范圍從匯管區(qū)纖維沉積部位到肝竇壁均有明顯陽(yáng)性著色。陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度半定量分析顯示CCl4誘導(dǎo)肝纖維化早期各時(shí)點(diǎn)大鼠Col IV陽(yáng)性表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中以CCl4造模2周與4周時(shí)，大鼠Col IV陽(yáng)性表達(dá)范圍及強(qiáng)度均顯著增加，與造模1周時(shí)比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

5 CCl4誘導(dǎo)肝纖維化早期大鼠肝組織LN的表達(dá)

SP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示肝纖維化早期大鼠肝組織LN陽(yáng)性著色分布與Col IV類似，但陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度較Col IV弱。陽(yáng)性表達(dá)半定量分析結(jié)果顯示大鼠LN表達(dá)在CCl4造模后陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)，尤其在造模第4周時(shí)LN陽(yáng)性表達(dá)最明顯，與CCl4造模2周比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5. The expression of laminin in the early stage of liver fibrosis (SP immunohistochemistry, ×200). N: normal control group; M: liver fibrotic model group. Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs N; #P<0.05 vs 2 weeks.

討 論

本研究通過(guò)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，動(dòng)態(tài)觀察肝纖維化形成早期肝竇內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜的形態(tài)變化過(guò)程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在肝纖維化早期(CCl4造模4周后)大鼠局部肝臟組織可形成典型肝竇毛細(xì)血管化的改變且肝竇壁上LN的沉積是肝竇毛細(xì)血管化連續(xù)基底膜形成的關(guān)鍵因素。

肝竇毛細(xì)血管化是肝纖維化過(guò)程中重要的病理改變, 研究提示肝竇毛細(xì)血管化先于肝纖維化的形成[5-6]。LSECs失窗孔和內(nèi)皮下連續(xù)性BM形成是其主要特征。在肝纖維化形成過(guò)程中動(dòng)態(tài)觀察肝竇毛細(xì)血管化的形成有利于后續(xù)抗肝竇毛細(xì)血管化研究的作用靶點(diǎn)選擇。故本實(shí)驗(yàn)選用經(jīng)典肝纖維化造模方法CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化以觀察肝竇毛細(xì)血管化的形成，結(jié)果顯示當(dāng)肝組織以炎癥反應(yīng)為主時(shí)(造模第3天和1周時(shí))LSECs主要表現(xiàn)為窗孔直徑減小與數(shù)目的減少，而網(wǎng)狀纖維沉積增多與基底膜的形成密切相關(guān)并且在早期肝纖維化形成時(shí)(造模第4周時(shí))肝臟局部可見(jiàn)典型的肝竇毛細(xì)血管化形成(肝竇可見(jiàn)LSECs窗孔消失及連續(xù)BM)，與國(guó)外報(bào)道相似[7-8]。

肝竇毛細(xì)血管化的特征之一是LSECs表型發(fā)生改變，LSECs表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)志物明顯增強(qiáng)[2]。CD31是常見(jiàn)的血管內(nèi)皮標(biāo)記物，正常LSECs不表達(dá)CD31，但肝纖維化過(guò)程中LSECs表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD31逐漸增強(qiáng)[9-10]，有研究顯示新分離的LSECs是胞內(nèi)表達(dá)CD31而培養(yǎng)后則形成表面表達(dá)，掃描電鏡觀察通過(guò)CD31磁珠分選得到的LSECs 表面末見(jiàn)窗孔[11]，提示CD31的表達(dá)與LSECs的窗孔狀態(tài)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝臟中CD31陽(yáng)性染色區(qū)域及染色程度與LSECs的窗孔變化密切相關(guān)，隨著LSECs窗孔逐漸減少至消失而肝竇內(nèi)皮CD31的表達(dá)逐漸增強(qiáng)并在肝竇局部形成毛細(xì)血管化時(shí)(造模第4周時(shí))表達(dá)最明顯，提示CD31表達(dá)增強(qiáng)反映失窗孔或窗孔數(shù)目減少的LSECs增多。

肝竇壁上形成連續(xù)的BM是肝竇毛細(xì)血管化的另一重要特征。連續(xù)的BM的主要成份是糖蛋白和基底膜膠原，其中以LN和Col IV為主。LN是ECM中的一種大分子非膠原黏蛋白, 能與膠原等結(jié)合形成BM結(jié)構(gòu), 影響細(xì)胞的黏附，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化, 并與肝纖維化發(fā)生及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]。正常的肝竇壁僅見(jiàn)以新合成的不連續(xù)的Col IV為主，而無(wú)LN[13]。免疫組化染色顯示正常大鼠中央靜脈、匯管區(qū)血管、膽管內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜，肝竇壁可見(jiàn)微弱、斷續(xù)的Col IV及LN陽(yáng)性著色。有報(bào)道肝纖維化早期，以Col IV為主的功能性基底膜破壞，Col IV變?yōu)檫B續(xù)性，同時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)LN，形成毛細(xì)血管化[13]，提示肝竇毛細(xì)血管化的啟動(dòng)與Col IV密切相關(guān)而肝竇毛細(xì)血管化的形成與Col IV與LN相互交聯(lián)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示造模第2周時(shí)肝組織網(wǎng)狀纖維沉積增多但肝竇內(nèi)皮下未見(jiàn)連續(xù)的BM，免疫組化顯示此時(shí)肝竇壁BM成分以Col IV陽(yáng)性著色顯著增多為主，提示Col IV是此時(shí)肝竇壁BM的主要成分。隨著CCl4損傷的持續(xù)，于造模第4周部分肝組織局部的肝竇內(nèi)皮下可形成連續(xù)的BM，此時(shí)免疫組化顯示肝組織中Col IV沉積持續(xù)增多同時(shí)伴隨著糖蛋白LN表達(dá)增多，結(jié)果提示肝纖維化早期肝臟局部肝竇毛細(xì)血管化形成可見(jiàn)連續(xù)的BM是Col IV與LN表達(dá)共同作用的結(jié)果。

綜上所述，CCl4誘導(dǎo)肝纖維化早期大鼠肝臟局部可形成典型的肝竇毛細(xì)血管，其主要表現(xiàn)為肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔直徑的減小、窗孔數(shù)量的減少以及由Col IV與LN沉積共同構(gòu)成連續(xù)的基底膜，其中LN的沉積是連續(xù)基底膜形成的必要條件之一，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步的抗肝竇毛細(xì)血管化研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

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