miRNA-24對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)調(diào)節(jié)及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響*

張文宇， 王 輝， 李玉媚， 陳 偉， 胡 楠， 歐和生

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 廣西 南寧 530021)

微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)約22 nt的一類高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，其通過序列特異性方式調(diào)控mRNA的降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯。約有30%人類基因的表達(dá)受到miRNAs的精細(xì)調(diào)控[1]。近年來研究表明，某些miRNAs參與血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖與凋亡的過程[2-3]；更重要的是，這類miRNAs不但與內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能密切相關(guān)，而且參與心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展[4-5]。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)作為限速酶介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生成NO，后者在維持血管正常舒張功能、內(nèi)皮損傷后的修復(fù)以及血小板聚集的抑制等方面起著至關(guān)重要的作用[6-8]。人類eNOS基因位于7q35～36，其核心啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)順式作用元件，其中就包括了一些核轉(zhuǎn)錄因子的高親和力結(jié)合位點(diǎn)，例如Sp1。作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，Sp1通過增強(qiáng)eNOS基因的轉(zhuǎn)錄活性誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖[9]。令人感興趣的是， 新近有研究提示miRNA-24參與Sp1的表達(dá)調(diào)控[10]。為探討miRNA-24 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及其對(duì)eNOS表達(dá)調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體將構(gòu)建的miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)，觀測(cè)HUVECs的增殖情況，并檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子Sp1與eNOS mRNA及蛋白表達(dá)的變化情況。

材 料 和 方 法

1 材料

人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)；改良型RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基[海克隆生物化學(xué)制品(北京)有限公司]；Gibco 公司胎牛血清(天津?yàn)笊镉邢薰?；載體miRNASelectTMpEGP-miR(Cell Biolabs)；質(zhì)粒提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen)；總RNA 提取試劑盒(TRIzol法；北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；RT試劑盒(MBI)；PCR 試劑盒(天根生化科技有限公司)；引物合成及Sp1高表達(dá)質(zhì)粒[寶成生物工程(大連)有限公司]；eNOS兔源單克隆抗體(Cell Signaling)。

2 方法

2.1miRNA-24的構(gòu)建和鑒定 miRNA-24序列(來自http://www. miRbase.org)為5’-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3’；通過DNA合成技術(shù)得到第1鏈DNA，利用DNA連接反應(yīng)合成相應(yīng)的雙鏈DNA，最后將擴(kuò)增后體外重組的DNA插入pEGP-miR載體轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α宿主菌，將1.5 mL菌液(經(jīng)酶切初步證實(shí)插入正確的單克隆菌落)提取質(zhì)粒DNA寄上海生工進(jìn)行DNA 序列測(cè)定。

2.2HUVECs的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HUVECs用含有1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。選用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體作為介質(zhì)，轉(zhuǎn)染4 h后更換含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h觀察免疫熒光。根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為miRNA-24表達(dá)組、 miRNA-24抑制(anti-miRNA-24)組和質(zhì)粒對(duì)照組。

2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs至96孔板，分別在每孔接種2×103個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到50%融合時(shí)更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h實(shí)現(xiàn)細(xì)胞同步生長(zhǎng)。分別于不同時(shí)段加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，按生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A570值/對(duì)照組A570值)×100% 的公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

2.4免疫組化檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后eNOS和Sp1的表達(dá) 將無菌玻片放入24孔板，加入細(xì)胞(每孔2×104個(gè)HUVECs)培養(yǎng)24 h，更換轉(zhuǎn)染劑培養(yǎng)4 h，轉(zhuǎn)染成功后取爬片，PBS沖洗3次，中性樹脂粘片，4%甲醛固定。用TritonX-100(10 min)和3%過氧化氫(30 min)處理后雙蒸水沖洗3次，敷Ⅰ抗、Ⅱ抗后顯色劑顯色。

2.5RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后eNOS和Sp1 mRNA的表達(dá) 按照TRIzol試劑盒說明書提取各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞總RNA。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)合成人eNOS、Sp1以及β-actin的引物，序列見表1。 取細(xì)胞總RNA 1 μg，加入1.0 μL(0.5 g/L)Oligo(dT)18引物，70 ℃變性5 min，迅速置于冰上冷卻。加入4 μL 5×reaction buffer，1 μL RiboLockTMRibonuclease Inhibitor (20 U/μL)，2 μL 10 mmol/L dNTP Mix，37 ℃溫育5 min，加入1 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶，42 ℃ 1 h，之后70 ℃ 10 min終止反應(yīng)，合成cDNA第1條鏈。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性5 min后，開始30 個(gè)循環(huán)：94 ℃ 30 s、56 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min；最后72 ℃ 5 min，終止反應(yīng)。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 引物序列

2.6Western blotting檢測(cè)eNOS和Sp1蛋白的表達(dá) 將成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清。各實(shí)驗(yàn)組分別取蛋白30 μg進(jìn)行SDS-PAGE(8%)分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)脫脂奶粉封閉1 h后加入eNOS和Sp1 Ⅰ抗過夜(4 ℃)。TBST沖洗3次(每次10 min)，加入Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)孵育，1 h后重復(fù)用TBST沖洗(方法同上)。利用LI-COR公司的Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miRNA-24對(duì)HUVECs增殖的影響

與對(duì)照組比較，miRNA-24表達(dá)組細(xì)胞數(shù)目72 h明顯減少54.06% (7.97±0.15vs17.35±0.40,P<0.01)，miRNA-24抑制組細(xì)胞數(shù)目降低29.56% (12.22±0.22vs17.35±0.40,P<0.01)；而與miRNA-24表達(dá)組比較，miRNA-24抑制組細(xì)胞數(shù)目則增加34.77%(12.22±0.22vs7.97±0.15,P<0.01)。轉(zhuǎn)染12 h、24 h及48 h后的結(jié)果與上述結(jié)果類似，見圖1。

Figure 1. Effect of miR-24 on endothelial cell growth. The number of endothelial cells was obtained by blood cell counting chamber.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group.

用MTT法分別檢測(cè)以上3組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間段細(xì)胞增殖的情況如圖2所示，miRNA-24表達(dá)組細(xì)胞增殖明顯受到抑制，72 h miRNA-24表達(dá)組的細(xì)胞抑制率最大，與對(duì)照組相比降低41.97%(0.47±0.04vs0.81±0.03,P<0.05)，miRNA-24抑制組降低17.28%(0.67±0.04vs0.81±0.03,P<0.05)。結(jié)果表明，miRNA-24參與抑制HUVECs的增殖。

Figure 2. Effect of miR-24 on the proliferation of endothelial cells measured by MTT assay at different time points (12 h, 24 h, 48 h and 72 h). Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.

2 miRNA-24對(duì)eNOS蛋白表達(dá)的影響

免疫組化的結(jié)果判定是以棕黃色為陽(yáng)性，eNOS蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿，eNOS蛋白表達(dá)量以對(duì)照組最高而miRNA-24表達(dá)組則最低，見圖3。Western blotting的檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miRNA-24表達(dá)組的eNOS蛋白表達(dá)量下降71.92% (0.16±0.06vs0.57±0.08，P<0.05)，miRNA-24抑制組下降36.84%(0.36±0.07vs0.57±0.08，P<0.05);而與miRNA-24表達(dá)組比較，miRNA-24抑制組增加55.56%(0.36±0.07vs0.16±0.06)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miRNA-24對(duì)eNOS蛋白表達(dá)有影響，見圖4。

Figure 3. Effect of miRNA-24 on the protein expression of eNOS (immunohistochemical staining,×400).1: control; 2: miRNA-24 inhibitor; 3: miRNA-24. The protein of eNOS was showed in color of brown by the arrows.

Figure 4. Effect of miR-24 on the protein expression of eNOS detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.

3 miRNA-24對(duì)eNOS mRNA水平的影響

與對(duì)照組比較，miRNA-24高表達(dá)組的eNOS mRNA表達(dá)量降低44.8% (0.48±0.01vs0.87±0.03，P<0.05)，miRNA-24抑制組的eNOS mRNA表達(dá)量降低21.8%(0.68±0.02vs0.87±0.03，P<0.05)，miRNA-24抑制組則比高表達(dá)組增加29.4%(0.68±0.02vs0.48±0.01，P<0.05)，見圖5。結(jié)果顯示，miRNA-24抑制eNOS的轉(zhuǎn)錄。

Figure 5. The effect of miRNA-24 on the mRNA expression of eNOS measured by PT-PCR.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.

4 miRNA-24對(duì)Sp1蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組Sp1的表達(dá)量最高，相反，miRNA-24表達(dá)組的Sp1表達(dá)量最低。通過Western blotting對(duì)Sp1蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析，miRNA-24表達(dá)組轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)量比對(duì)照組下調(diào)58.1%(0.13±0.07vs0.31±0.09，P<0.05)；miRNA-24抑制組轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)量比對(duì)照組下調(diào)22.6% (0.24±0.06vs0.31±0.09，P<0.05)，與miRNA-24表達(dá)組比較，抑制組蛋白表達(dá)量則增加45.8%(0.24±0.06vs0.13±0.09，P<0.05)，見圖6、7。結(jié)果顯示，miRNA-24明顯抑制轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)。

Figure 6. Effect of miR-24 on the protein expression of Sp1 (immunohistochemical staining,×400). 1: control; 2: miR-24 inhibitor; 3: miR-24. The protein expression of Sp1 was showed in color of brown by the arrow.

Figure 7. Effect of miR-24 on the protein expression of Sp1 detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.

4 miR-24對(duì)Sp1 mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，miRNA-24高表達(dá)組的Sp1 mRNA表達(dá)量降低53.00%(0.45±0.02vs0.93±0.01，P<0.05)，miRNA-2抑制組的 Sp1 mRNA表達(dá)量降低33.33%(0.62±0.03vs0.93±0.01，P<0.05)，miRNA-24抑制則比高表達(dá)組增加29.00%(0.62±0.03vs0.93±0.01，P<0.05)，見圖8。結(jié)果顯示，miRNA-24抑制Sp1的轉(zhuǎn)錄。

Figure 8. Effect of miR-24 on the mRNA expression of Sp1 measured by PT-PCR.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs control group.

討 論

本文通過研究miRNA-24對(duì)eNOS表達(dá)及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，主要有以下3個(gè)方面的發(fā)現(xiàn)：首先，eNOS基因是miRNA-24調(diào)控的重要分子靶標(biāo)，miRNA-24對(duì)調(diào)控eNOS的表達(dá)具有明顯的調(diào)節(jié)作用；其次，miRNA-24抑制eNOS表達(dá)的同時(shí)，也抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；第三，轉(zhuǎn)錄因子Sp1可能作為一個(gè)重要因子與miRNA-24對(duì)eNOS的表達(dá)和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的調(diào)節(jié)。據(jù)我們所知，這是第1次報(bào)道m(xù)iRNA-24參與內(nèi)皮特異性基因eNOS的表達(dá)調(diào)控; 同時(shí)，核轉(zhuǎn)錄因子Sp1作為重要的調(diào)節(jié)分子與miRNA-24共同參與對(duì)eNOS的表達(dá)調(diào)控。

作為生成NO的關(guān)鍵酶，eNOS具有組織特異性，即主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)異常與許多心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11-12]；而眾多的研究表明，miRNA的特異性改變參與了人類重大疾病(如癌癥、糖尿病、心血管疾病等)的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[13]。因此，miRNA是否對(duì)eNOS的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，以及是否對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生影響，是一個(gè)很重要的研究課題。Wang等[14]在2008年發(fā)現(xiàn)敲除miRNA-216的小鼠出現(xiàn)血管破裂、出血甚至部分胚胎死亡，其原因在于血管完整性的破壞以及內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力的改變；miRNA-132通過抑制p120 RASGAP的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、生存與移行的調(diào)節(jié)[15]。此外，miRNA-223作為另外一個(gè)抗血管新生的miRNA，可以通過結(jié)合于整合素β1部分抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖[16]。氧化應(yīng)激時(shí)，miRNA-24過表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過furin-TGF-β通道m(xù)iRNA-24參與心肌的纖維化過程,此外，miRNA-24可以減少缺血、缺氧條件下的細(xì)胞凋亡并改善心肌梗死引起的心臟重塑[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-24高表達(dá)組內(nèi)皮細(xì)胞增殖速度降低，eNOS蛋白顯著減少，而miRNA-24抑制組則與高表達(dá)組相反，這一結(jié)果強(qiáng)烈提示，miRNA-24參與內(nèi)皮特異性eNOS基因調(diào)控，并抑制HUVECs增殖。值得注意的是，大多數(shù)miRNAs通常是在轉(zhuǎn)錄水平抑制或者降解靶基因，然而我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，一些內(nèi)含子源性的miRNAs可能在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[18]。因此，我們進(jìn)一步對(duì)eNOS mRNA改變情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，eNOS mRNA的表達(dá)被miRNA-24明顯抑制，這提示，miRNA-24可能在eNOS基因轉(zhuǎn)錄的階段就對(duì)其進(jìn)行了調(diào)控；這一過程可能與一些核轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，如Sp1。

血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖在許多心血管疾病的病理生理過程都起著十分重要的作用[19-20]。eNOS表達(dá)的改變與相關(guān)心血管疾病的發(fā)生緊密相關(guān)。有證據(jù)顯示，miRNA與核轉(zhuǎn)錄因子作為2類主要的反式作用因子，在調(diào)控真核細(xì)胞基因組的過程中有著廣泛的聯(lián)系[21-22]。定位于7q35～36的eNOS基因，其啟動(dòng)子下游區(qū)域有許多與其轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的順式作用元件，尤其是-104位到-95位的正向調(diào)控區(qū)Ι則是轉(zhuǎn)錄因子Sp1的高親和位點(diǎn)[7]。本研究還發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子Sp1伴隨著miRNA-24的高表達(dá)而降低。Sp1作為結(jié)合于eNOS增強(qiáng)子元件的重要轉(zhuǎn)錄因子[23]增強(qiáng)eNOS啟動(dòng)子的活性，促進(jìn)eNOS的轉(zhuǎn)錄，隨著HUVECs轉(zhuǎn)染了miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒以后，eNOS表達(dá)減少，內(nèi)皮細(xì)胞增殖減慢，Sp1表達(dá)量也下降，這說明Sp1參與了miRNA-24對(duì)eNOS表達(dá)的調(diào)控，我們推測(cè)其可能的分子機(jī)制是核轉(zhuǎn)錄因子Sp1表達(dá)量的減少，影響了其正向調(diào)控eNOS表達(dá)以及NO的合成，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的增殖受到抑制。

根據(jù)生物信息學(xué)分析顯示，Sp1與miRNA-24之間也存在互補(bǔ)序列。這提示Sp1可能就是miRNA-24的分子靶標(biāo)，我們進(jìn)一步通過RT-PCR檢測(cè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中Sp1 mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miRNA-24能明顯抑制Sp1 mRNA的表達(dá)，而miRNA-24抑制物則能夠部分抵消這種效應(yīng)。值得指出的是，由于Sp1和eNOS都是miRNA-24的靶標(biāo)，在邏輯上， miRNA-24的抑制物似乎能完全抵消二者對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)；然而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示， miRNA-24抑制物只能部分抵消miRNA-24高表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用；這一效應(yīng)在Sp1和eNOS表達(dá)的調(diào)節(jié)也有類似情況。造成這一效應(yīng)的原因至少有以下3個(gè)方面：第一，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是多因素調(diào)節(jié)的過程，而不是單一分子或基因所調(diào)控；第二，miRNA-24對(duì)eNOS表達(dá)的調(diào)控可能存在2種機(jī)制，一種是miRNA-24在轉(zhuǎn)錄階段直接抑制eNOS的表達(dá)，另外一種則通過調(diào)控eNOS基因的反式作用因子Sp1間接調(diào)控其表達(dá)。此外，Sp1和miRNA-24在對(duì)eNOS表達(dá)調(diào)控過程中所顯示出相反作用，進(jìn)一步提示，Sp1與miRNA-24可能作為一種協(xié)同機(jī)制維持eNOS在機(jī)體的正常表達(dá)；第三, 由于Sp1是eNOS的正性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一，而我們的結(jié)果顯示miRNA-24抑制組的eNOS表達(dá)高于miRNA-24組，我們認(rèn)為miRNA-24抑制物對(duì)eNOS的抑制程度高于Sp1，考慮到eNOS是內(nèi)皮細(xì)胞的組織特異性蛋白，相對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)控而言，這一結(jié)論更為合理。然而miRNA-24對(duì)Sp1的調(diào)控是否依賴其它因素，兩者是否有劑量依賴關(guān)系，尤其是這種關(guān)聯(lián)是否在其它的組織細(xì)胞中存在普遍性？這些問題有待進(jìn)一步研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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