胞外高濃度ATP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的自噬和凋亡*

盧 娜， 白瑞櫻， 魏林郁， 李超堃， 李新娟， 趙紅崗， 李東亮

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)不僅是體內(nèi)儲能供能物質(zhì)，還是細(xì)胞間傳遞信息的重要活性分子，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)神經(jīng)細(xì)胞釋放的ATP作為遞質(zhì)，對神經(jīng)功能的作用越來越受到關(guān)注[1]。生理?xiàng)l件下胞外ATP濃度在μmol/L水平，它通過核苷轉(zhuǎn)運(yùn)形式釋放至突觸間隙，可選擇性地作用于相應(yīng)嘌呤受體發(fā)揮遞質(zhì)調(diào)節(jié)、突觸修飾和神經(jīng)營養(yǎng)等作用。而當(dāng)CNS遭受各類應(yīng)激，如缺氧缺血、炎癥損傷后，受損細(xì)胞釋放大量ATP，胞外達(dá)到mmol/L的高水平，可引起神經(jīng)元繼發(fā)性死亡[2]。因此，研究ATP對神經(jīng)元毒性作用的特點(diǎn)及規(guī)律，揭示神經(jīng)元死亡方式，有可能為腦損傷和腦卒中的防治策略提供新思路。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y細(xì)胞)來自于神經(jīng)發(fā)育過程中的神經(jīng)嵴，表現(xiàn)出與神經(jīng)元相似的生化、藥理和功能方面的特性，提供了一個可以用來研究神經(jīng)元功能、分化及死亡的良好體外模型。本實(shí)驗(yàn)以SH-SY5Y細(xì)胞為對象，觀察ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬，以及兩者的時間順序特點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株由上海中科院典型細(xì)胞培養(yǎng)庫提供；DMEM培養(yǎng)液、新生牛血清購于HyClone；細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)購于廣州晶欣生物科技有限公司；annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)、細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒、鼠抗β-actin多克隆抗體及兔抗caspase-3單克隆抗體均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ, LC3-Ⅱ)單克隆抗體購自Abgent；FITC標(biāo)記驢抗鼠IgG(H+L)購自Laboratories；蛋白marker購自Fermentas。

2 主要方法

2.1SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM中，在37 ℃、5% CO2的飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h換培養(yǎng)液，當(dāng)單層細(xì)胞融合后，行傳代處理。傳代后隨機(jī)分為對照組和ATP作用1 h、3 h、6 h組，ATP各組培養(yǎng)液均更換為終濃度含6 mmol/L ATP 的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每次每組設(shè)5 個平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.2CCK-8比色法檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以5×107/L接種于96孔板，每孔細(xì)胞懸液100 μL。在37 ℃、5%CO2的飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，分別置換成終濃度含3、6、9、12和15 mmol/L ATP 的培養(yǎng)液。ATP 作用3 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液，避光孵育2 h，酶標(biāo)儀在波長450 nm 處讀取吸光度(absorbance，A)，用5孔A值的均數(shù)計算存活率。將對照組的A值表示為ACon，ATP 各組樣本的A值表示為AATP，存活率按下式計算: 存活率(%)=AATP/ACon×100%。本實(shí)驗(yàn)對照組的細(xì)胞存活率定為100.0%。

2.3MDC染色檢測自噬空泡 MDC是一種自噬空泡的標(biāo)志物, 可以通過MDC染色觀察判斷細(xì)胞自噬過程的發(fā)生[3]。采用Biederbick 等[4]實(shí)驗(yàn)方法，各組細(xì)胞爬片處理后，去培養(yǎng)基，用PBS 洗2 遍；然后加入0.05 mmol/L的MDC染色液，37 ℃孵育60 min；吸去染料后用4 ℃、4% 多聚甲醛固定5 min，PBS 洗2 次；晾干后立刻用熒光顯微鏡觀察，激發(fā)波長365 nm，阻斷波長430 nm；在200倍視野下，隨即取5個視野，用ImageJ軟件分析熒光強(qiáng)度值，代表細(xì)胞自噬表達(dá)的相對水平。重復(fù)3 次，計算平均值。

2.4Hoechst染色凋亡細(xì)胞 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以5×107/L接種于24孔板，每個孔細(xì)胞懸液500 μL；培養(yǎng)24 h后，置換成終濃度含6 mmol/L ATP 的培養(yǎng)液；ATP 作用1 h、2 h、3 h、6 h后棄培養(yǎng)液，每孔加1 mL細(xì)胞染色緩沖液和5 μL Hoechst 33258，冰浴染色30 min；PBS洗滌1次，立即在熒光顯微鏡下觀察。在200倍視野下，隨機(jī)取100個細(xì)胞，計數(shù)呈現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)光的凋亡細(xì)胞，并計算凋亡比率= 呈現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)光的細(xì)胞/100 個細(xì)胞，重復(fù)3 次，計算平均值。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞，經(jīng)消化制成細(xì)胞懸液, 以5×106細(xì)胞數(shù)接種于培養(yǎng)瓶中, 細(xì)胞貼壁后加入ATP，終濃度為6 mmol/L，分別在1 h、2 h、3 h、6 h后, PBS洗2遍，收集細(xì)胞，棄上清，分別加入1 mg/L PI和anne-xin V-FITC, 37 ℃孵育15 min，PBS洗2遍，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。

2.6Western blotting法檢測caspase-3和LC3-2表達(dá) 收獲細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷的PBS洗1次，加入適量的細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，低溫離心機(jī)12 000 ×g離心10 min，取上清液，棄沉淀。用BCA法測定各組蛋白含量，每孔上樣25 μL蛋白，經(jīng)15% SDS-PAGE 80 V電泳2 h后，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜40 min，5% 脫脂牛奶常溫下封閉1 h后，在4 ℃孵育Ⅰ抗(兔抗人caspase-3滴度為1∶1 000、小鼠抗人LC3-Ⅱ滴度均為1∶2 000、小鼠抗人β-actin滴度均為1∶3 000)；5%脫脂牛奶常溫下封閉Ⅱ抗(羊抗兔辣根過氧化物酶IgG 和羊抗小鼠辣根過氧化物酶IgG 滴度均為1∶5 000，5% 脫脂牛奶配制)，ECL 顯影顯示目的條帶和內(nèi)參，用SIGMA Photo Pro 5.0軟件分析光密度值，代表蛋白表達(dá)的相對水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度 ATP作用3 h對SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置相差光學(xué)顯微鏡下觀察SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的變化，正常SH-SY5Y 細(xì)胞大部分呈梭形、三角形，少數(shù)呈多邊形，胞漿內(nèi)有大量顆粒，多數(shù)可見細(xì)胞突起，折光性好，貼壁能力強(qiáng); 隨著ATP作用濃度增加，細(xì)胞貼壁數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)閳A形，體積皺縮，突起減少或消失，折光性逐漸減弱；脫壁的細(xì)胞增加，表明ATP對SH-SY5Y 細(xì)胞損傷作用有濃度依賴性，見圖1。

Figure 1. Effect of different concentrations of ATP on the morphology of SH-SY5Y cells (×200). A: 0 mmol/L; B: 3 mmol/L; C: 6 mmol/L; D: 9 mmol/L; E: 12 mmol/L; F: 15 mmol/L.

2 不同濃度 ATP作用3 h對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

CCK-8法檢測結(jié)果以空白對照組細(xì)胞存活率為100.0%，則3、6、9、12和15 mmol/L ATP組存活率分別為72.6%、55.8%、40.3%、20.8%和8.1%，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨胞外ATP濃度增高，細(xì)胞存活率逐漸降低，呈劑量依賴性，見表1。

表1 不同濃度ATP對SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的影響

3 ATP(6 mmol/L)對SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，6 mmol/L ATP作用1 h、2 h、3 h和6 h，SH-SY5Y 細(xì)胞存活率分別為對照組的69.4%、62.3%、54.7%和53.1%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著ATP作用時間的延長，細(xì)胞存活率呈時間依賴性逐漸降低，3 h達(dá)高峰，3 h和6 h組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 ATP作用不同時間對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

4 MDC染色檢測細(xì)胞自噬空泡

MDC染色結(jié)果表明，與正常對照組相比， 6 mmol/L ATP作用1 h，細(xì)胞內(nèi)MDC點(diǎn)狀熒光信號明顯增強(qiáng)，提示細(xì)胞出現(xiàn)大量自噬空泡；而2 h、3 h和6 h后MDC熒光信號逐漸減弱，提示細(xì)胞內(nèi)自噬泡減少，見圖2。

Figure 2. Effect of ATP (6 mmol/L) treatment for different time on the formation of autophagic vacuoles (MDC staining,×400).Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs control group; ##P<0.05 vs 1 h group.

5 熒光染色檢測細(xì)胞凋亡率

Hoechst染色結(jié)果表明，正常對照組細(xì)胞染色質(zhì)均勻，發(fā)出均勻淺藍(lán)色熒光，核呈正常結(jié)構(gòu); 6 mmol/L ATP作用后，大量細(xì)胞染色質(zhì)固縮，胞核致密深染，胞內(nèi)可見亮藍(lán)色熒光。3 h凋亡率達(dá)高峰，見圖3。

6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

與正常對照組相比，6 mmol/L ATP作用后，早期凋亡率明顯增加，并呈時間依賴性，3 h凋亡率達(dá)高峰。ATP作用1 h、2 h、3 h和6 h后凋亡率分別為(12.33±0.43)%、(30.27±0.24)%、(41.65±0.36)% 和(40.71±0.29)%，見圖4。

7 Western blotting法檢測 caspase-3和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的變化

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與正常對照組比較，6 mmol/L ATP作用后，各組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量均增加(P<0.05)，6 h達(dá)高峰；LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量在作用1 h、2 h和3 h明顯增加(P<0.05)，1 h表達(dá)量最高，然后隨時間延長而逐漸降低，見圖5。

Figure 3. Effect of ATP (6 mmol/L) treatment for different time on the changes of apoptotic rates of SH-SY5Y cells (Hoechst 33342 staining,×200). The arrows indicate the apoptotic cells with sapphirine color. Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 3 h group.

討 論

自噬(autophagy)是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象[5], 這一過程在細(xì)胞清除廢物、重建結(jié)構(gòu)、生長發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用[6]；并參與了如腦損傷、神經(jīng)退行性改變、精神分裂癥等多種疾病的發(fā)病過程[7]。細(xì)胞在受到外界因素刺激，如饑餓、缺氧、高溫，或在細(xì)胞內(nèi)部應(yīng)激等多種情況下，均可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[8]。LC3是目前觀察自噬現(xiàn)象是否存在、研究自噬活性較為可靠的生物學(xué)標(biāo)志物,它哺乳動物細(xì)胞中酵母ATG8(Aut7/Apg8)基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成。LC3 有Ⅰ型和Ⅱ型之分，未發(fā)生自噬時，細(xì)胞內(nèi)合成的LC3 經(jīng)過加工，成為胞質(zhì)可溶性的LC3-Ⅰ，常規(guī)表達(dá)。當(dāng)自體吞噬發(fā)生時，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾過程，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ結(jié)合并始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上，其含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比。因此LC3-Ⅱ表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)[9]。目前，大多數(shù)研究證實(shí)自噬具有腦保護(hù)作用，當(dāng)神經(jīng)元遭遇應(yīng)激時，自噬最先被激活，當(dāng)自噬不能維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)后，細(xì)胞再繼發(fā)凋亡，最后進(jìn)入壞死；且自噬與凋亡可同時存在于神經(jīng)元[10]，推測自噬在腦損傷后可能發(fā)揮清除受損細(xì)胞及降低正常細(xì)胞損害的作用。

Figure 4. ATP (6 mmol/L) induced apoptosis of SH-SY5Y cells detected by flow cytometry with annexin V-FITC/PI staining.Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 3 h group.

Figure 5. Effect of ATP (6 mmol/L) treatment for different time on the protein expression of cleaved caspase-3 and LC3-Ⅱ in SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=5. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs 6 h group; △P<0.05 vs 1 h group.

凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動死亡的一種過程。Caspase是一大類凋亡調(diào)控基因，對神經(jīng)元的凋亡起著非常關(guān)鍵的作用，而caspase-3被稱為死亡蛋白酶，是caspase家族中最重要的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者之一[11]。 Caspase-3正常狀態(tài)下以酶原(32 kD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的caspase-3由2個大亞基(17 kD)和2個小亞基(12 kD)組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。很多學(xué)者將活化的caspase-3作為指標(biāo)來檢測凋亡[12]。腦組織缺血、缺氧后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙，大量氧自由基的產(chǎn)生、興奮性氨基酸的蓄積和釋放及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等均可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。自噬發(fā)揮著雙刃劍的作用。一方面，自噬的過度激活可能介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡[13]，另一方面，自噬的啟動可能有助于維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)，減少繼發(fā)損傷，清除已經(jīng)被損傷的細(xì)胞器而保護(hù)神經(jīng)元[14]。那么SH-SY5Y細(xì)胞在ATP的損傷下，自噬能否被激活？和凋亡有何關(guān)系？

本研究CCK-8結(jié)果表明, 隨胞外ATP濃度增高，細(xì)胞存活率逐漸降低，呈劑量依賴性(表1)；同時隨胞外6 mmol/L ATP作用時間延長，細(xì)胞存活率逐漸降低，呈時間依賴性，3 h達(dá)高峰(表2)。這提示ATP損傷過程中細(xì)胞的增殖過程受到影響。通過Hoechst染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率均顯示, 與正常對照組相比, 應(yīng)用6 mmol/L ATP作用后，細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)，并呈時間依賴性，3 h凋亡率達(dá)高峰(圖3、4)，表明ATP作用SH-SY5Y細(xì)胞啟動了凋亡程序。同時我們檢測了ATP在作用SH-SY5Y細(xì)胞時自噬的變化, 熒光顯微鏡MDC染色結(jié)果表明, ATP能夠引起SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生自噬并且在1 h時就可以觀察到自噬空泡明顯增多(P<0.05), 而2 h、3 h和6 h后MDC熒光信號逐漸減弱，細(xì)胞內(nèi)自噬泡減少(圖2)，提示自噬對細(xì)胞損傷結(jié)構(gòu)的清理修復(fù)作用在進(jìn)行；而細(xì)胞凋亡則在3 h達(dá)高峰，表明ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷中自噬增強(qiáng)發(fā)生在凋亡高潮之前。

我們進(jìn)一步通過Western blotting對凋亡相關(guān)蛋白caspase-3及自噬特異性蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)進(jìn)行檢測, 發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量隨時間逐漸增高，6 h達(dá)高峰；同時發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量在1 h達(dá)最高值，而后隨時間延長而逐漸降低(圖5)，與相關(guān)研究結(jié)果基本相符[15]。說明ATP同時激活SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡，自噬增強(qiáng)在前，凋亡高潮在后。有研究表明，自噬空泡的積聚出現(xiàn)在凋亡之前并且不被凋亡抑制劑所影響, 而自噬被抑制后, 細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3活化水平顯著增加[16]。因此, 我們推測ATP損傷的早期, 很可能優(yōu)先啟動細(xì)胞自噬機(jī)制，降解受損的細(xì)胞器等胞內(nèi)物質(zhì), 以提供維持細(xì)胞生存的氨基酸和能量等, 來延緩細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生，對細(xì)胞的存活起一定的保護(hù)作用[17], 但隨著ATP作用時間的延長, 凋亡逐漸占主導(dǎo)地位, 自噬失去其拮抗凋亡作用, 從而表現(xiàn)細(xì)胞死亡加速[10]。

綜上所述本研究提示，胞外高濃度ATP啟動SH-SY5Y細(xì)胞自噬和凋亡，自噬增強(qiáng)在前，凋亡高潮在后。研究ATP這種神經(jīng)系統(tǒng)廣泛存在的膠質(zhì)遞質(zhì)(gliotransmitter)啟動和調(diào)控自噬與凋亡機(jī)制，或許能夠?yàn)閼?yīng)對神經(jīng)元損傷提供新的策略。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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