免疫抑制劑FK506所致血糖升高副作用的機(jī)制研究*

張 玲， 孫 萌， 史 波， 唐麗麗， 吳存造， 蔡 勇， 夏 鵬， 鄭少玲， 楊亦榮， 陳必成

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

移植術(shù)后糖尿病(post-transplantation diabetes mellitus，PTDM)是實(shí)體臟器移植后常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響移植受者的長(zhǎng)期生存率及移植臟器的存活率。據(jù)報(bào)道，PTDM的發(fā)病率因移植臟器的不同而有所差別，范圍波動(dòng)在4%～50%[1]。大量研究表明[2]，免疫調(diào)節(jié)劑鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor, CaNI)的大量運(yùn)用是PTDM的重要危險(xiǎn)因素之一。臨床常用的CaNI以FK506和環(huán)孢霉素A(cyclosporin A, CsA)為主， 且FK506比CsA更易誘導(dǎo)PTDM[3]。目前，多數(shù)基礎(chǔ)研究主要關(guān)注FK506對(duì)胰島細(xì)胞的損傷及胰島素分泌的影響。也有研究表明[4-5]，使用CaNI的移植術(shù)后患者早期血胰島素水平普遍會(huì)高于正常組。FK506作為胰島移植術(shù)后最常用的免疫抑制劑之一,其誘導(dǎo)PTDM的機(jī)制存在矛盾之處。本研究通過(guò)建立動(dòng)物模型，嘗試闡述FK506對(duì)大鼠脂肪因子分泌譜及其關(guān)鍵信號(hào)通路PPAR-γ的影響，以進(jìn)一步揭示FK506誘導(dǎo)糖耐量損傷的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料及設(shè)備

FK506(國(guó)藥準(zhǔn)字J20090142)購(gòu)于安斯泰來(lái)制藥(中國(guó))有限公司；生理鹽水購(gòu)于上海麗臣生物科技有限公司；水合氯醛購(gòu)于上海京索來(lái)寶生物科技有限公司；血糖儀及血糖試紙購(gòu)于長(zhǎng)沙三諾生物傳感股份有限公司；Trizol試劑購(gòu)于Gibco；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green I熒光定量試劑盒購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成(引物序列見(jiàn)表1)；PPAR-γ、adiponectin、GAPDH兔抗大鼠Ⅰ抗以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG Ⅱ抗購(gòu)于Abcam；所用熒光定量PCR儀ABI7500購(gòu)于ABI。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 動(dòng)物分組與模型制備

雄性SD大鼠12只，9周齡，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001，初始體重為(188.65±12.71)g，血糖(4.86±0.44)mmol/L。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2) ℃，保持通風(fēng)，自然晝夜節(jié)律變化，相對(duì)濕度40%～60%。給予動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料，1只1籠喂養(yǎng)。

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組(每組6只)。給藥組大鼠給予腹腔注射1 mg·kg-1·d-1FK506 (1 mg溶于2 mL生理鹽水)；對(duì)照組大鼠給予腹腔注射1 mL·kg-1·d-1生理鹽水。在禁食不禁水8 h后，每天測(cè)空腹體重1次。用藥后，用大鼠固定器固定大鼠，斷尾取血，每2 d測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。

3 標(biāo)本的留取與保存

給藥第15天，禁食8 h后，給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/kg)，固定，消毒。經(jīng)下腔靜脈放血后，取大鼠腹腔內(nèi)臟脂肪及附睪脂肪組織，以預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水份后放入凍存管，迅速轉(zhuǎn)入液氮降溫，-80 ℃長(zhǎng)期保存。

4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)靶基因表達(dá)情況

用 Trizol試劑盒提取給藥組和對(duì)照組大鼠脂肪組織的總RNA。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，吸取2 μg RNA樣本在10 μL體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR擴(kuò)增體系為：5 μL熒光定量染料2×SYBR熒光定量試劑、2 μL引物(上、下游各1 μL)、2 μL Plus反應(yīng)液、1 μL cDNA。檢測(cè)靶基因包括: 氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPAR-γ)、脂聯(lián)素 (adiponectin)、抵抗素 (resistin)、瘦素 (leptin)、內(nèi)酯素 (visfatin)、視黃醇結(jié)合蛋白4 (retinol-binding protein 4, RBP4)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min后，進(jìn)行95 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。得到的Ct值用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)的變化(結(jié)果為倍數(shù)關(guān)系)。

5 Western blotting法檢測(cè)靶蛋白表達(dá)情況

裂解液(RIPA)提取給藥組與對(duì)照組大鼠脂肪組織蛋白。凍融后的脂肪組織100 mg在冰上剪碎，加入1 mL 含1% PMSF的裂解液，作用60 min后吸取提取液； 12 000 r/min 離心30 min，取上清液測(cè)蛋白濃度；制備10%聚丙烯酰胺分離膠和5%濃縮膠，樣品5×SDS上樣緩沖液, 設(shè)置恒壓100 V, 電泳60 min；設(shè)置恒流350 mA，濕法電轉(zhuǎn)移(脂聯(lián)素30 min，PPAR-γ 55 min)， 轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜經(jīng)5% TBST脫脂奶粉室溫封閉2 h；然后加Ⅰ抗(稀釋在Ⅰ抗稀釋液中)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)種屬Ⅱ抗，室溫孵育1.5 h，ECL發(fā)光液孵育膜5 min，暗室壓片曝光，顯影定影后膠片保存。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示, 采用Microsoft Excel 2003統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況及大鼠體重的變化

在觀(guān)察時(shí)間內(nèi)，大鼠活動(dòng)正常，各組大鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。2組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體重緩慢增加，第14天后2組大鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)圖1。可排除體重對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

Figure 1. The changes of body weight in the rats fasted for 8 h.Mean±SD.n=6.

2 2組大鼠FBG變化

在實(shí)驗(yàn)期間前10 d內(nèi)，2組大鼠FBG值無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖2。在第10天后，給藥組大鼠FBG趨勢(shì)發(fā)生變化，第12天的空腹血糖首次大于7 mmol/L。第13天、第15天連續(xù)監(jiān)測(cè)FBG，給藥組大鼠持續(xù)≥7 mmol/L，而對(duì)照組大鼠血糖始終<6.5 mmol/L。給藥組大鼠FBG顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組大鼠FBG無(wú)顯著變化(P>0.05)。

3 2組大鼠脂肪組織PPAR-γ mRNA的表達(dá)

2組大鼠脂肪組織PPAR-γ mRNA的表達(dá)差異顯著(P<0.05)。給藥組大鼠PPAR-γ mRNA的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)圖3。

Figure 2. The changes of fasting blood glucose in adult rats observed for 2 weeks.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs normal.

Figure 3. The mRNA expression of PPAR-γ in adipose tissues of the rats treated with FK506 or saline (normal).Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs normal.

4 2組大鼠脂肪因子mRNA表達(dá)的變化

與對(duì)照組相比，給藥組大鼠脂聯(lián)素的表達(dá)下降到20%，瘦素的表達(dá)下降到60%，差異顯著(P<0.05)；而內(nèi)酯素、抵抗素及RBP4的表達(dá)相對(duì)升高，分別升高至對(duì)照組的3倍、2倍及1.6倍(P<0.05),見(jiàn)圖4。

5 2組大鼠脂肪組織PPAR-γ及脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)變化

2組大鼠脂肪組織PPAR-γ及脂聯(lián)素蛋白表達(dá)差異顯著。與對(duì)照組相比，給藥組大鼠PPAR-γ蛋白的表達(dá)量下降到40%，脂聯(lián)素下降到19%(P<0.05),見(jiàn)圖5、6。

討 論

FK506是目前在臨床運(yùn)用最為廣泛的CaNI免疫抑制劑，主要通過(guò)calcineurin/NFAT通路，抑制T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。目前，多數(shù)研究認(rèn)為，PTDM發(fā)生機(jī)制主要是FK506在抑制免疫反應(yīng)的同時(shí)，也通過(guò)calcineurin/NFAT通路作用于胰島β細(xì)胞，抑制胰島素的分泌[6]。也有體外研究表明，F(xiàn)K506可以作用于脂肪細(xì)胞，參與下調(diào)PPAR-γ的表達(dá)[7]。本研究表明，與對(duì)照組相比，給予FK506的大鼠FBG明顯升高；內(nèi)臟脂肪組織的PPAR-γ、脂聯(lián)素及瘦素mRNA的表達(dá)量降低，內(nèi)酯素、抵抗素及RBP4 mRNA的表達(dá)量升高。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)K506能夠調(diào)節(jié)脂肪組織中PPAR-γ及脂肪因子的表達(dá)。

Figure 4. The mRNA expression of adipocytokines in the rats fasted for 8 h and treated with FK506 or saline.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal.

Figure 5. The expression of PPAR-γ detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal.

Figure 6. The expression of adiponectin detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal.

早在2007年，Hernandez-Fisac等[8]用一定劑量的FK506成功建立PTDM大鼠模型，來(lái)研究FK506對(duì)胰島素基因表達(dá)的影響。本實(shí)驗(yàn)以此為參考，在排除大鼠體重對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾下，得到的FK506大鼠FBG明顯高于對(duì)照組。這充分說(shuō)明，F(xiàn)K506是影響大鼠空腹血糖變化及胰島素對(duì)血糖變化調(diào)節(jié)能力的獨(dú)立因素。FK506對(duì)血糖的影響，不僅僅是因?yàn)橐种埔葝u素的分泌，也有可能是誘導(dǎo)了胰島素抵抗。有研究證實(shí)[5]胰島素抵抗存在于PTDM患者血糖升高之前，并貫穿全過(guò)程。所以，胰島素抵抗可能是PTDM的始發(fā)因素。因?yàn)椋葝u素抵抗容易引起胰島素的積聚，高濃度的胰島素會(huì)降低胰腺β細(xì)胞對(duì)血糖的敏感性，引起血糖升高。而高血糖會(huì)抑制胰腺細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致胰島素分泌不足，最終共同引起血糖的升高。所以，F(xiàn)K506可能首先影響的是胰島素對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力，最終導(dǎo)致血糖變化。

目前，PPAR-γ在脂肪組織的胰島素抵抗方面起到了重要作用。研究表明[9]，PPAR-γ主要與調(diào)節(jié)脂肪組織脂肪因子分泌有關(guān)。脂肪因子是脂肪組織分泌的一類(lèi)細(xì)胞因子，可以直接作用于胰島素信號(hào)通路，調(diào)節(jié)血糖水平，可以改善胰島素抵抗。脂肪因子主要包括：脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素、內(nèi)酯素和RBP4等。其中，脂聯(lián)素具有增加脂肪酸氧化、提高葡萄糖攝取量、改善胰島素抵抗和抗炎的作用，具有胰島素增敏作用。人體實(shí)驗(yàn)證明[10]脂聯(lián)素與機(jī)體胰島素敏感性之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。瘦素可以抑制下丘腦的進(jìn)食中樞，減少食物的攝取量，促進(jìn)能量的消耗。但是，抵抗素、內(nèi)酯素及RBP4可以抑制細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，誘導(dǎo)高血糖狀態(tài)及胰島素抵抗。從本實(shí)驗(yàn)也可以看出，空腹血糖較高的 FK506處理大鼠，脂聯(lián)素及瘦素表達(dá)明顯降低，而抵抗素、內(nèi)酯素及RBP4明顯升高。同時(shí)，又有研究表明PTDM患者血清脂聯(lián)素低于正常[11]，而高水平脂聯(lián)素對(duì)PTDM起到了很好的保護(hù)作用。所以，F(xiàn)K506對(duì)脂肪因子的調(diào)變作用可以影響血糖的變化。

目前，普遍認(rèn)為脂肪因子的分泌主要與脂肪組織上的PPAR-γ通路有關(guān)。激活的PPAR-γ，與維甲酸類(lèi)受體或糖皮質(zhì)激素受體形成異二聚體，結(jié)合于特異性的DNA序列而使得靶基因激活，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控脂肪因子分泌的作用。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道，PPAR-γ激動(dòng)劑促進(jìn)脂聯(lián)素[12]及瘦素分泌[13]，抑制抵抗素及內(nèi)酯素分泌，改善胰島素抵抗。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)：FK506處理大鼠PPAR-γ表達(dá)量明顯降低，同時(shí)出現(xiàn)了脂聯(lián)素、瘦素的表達(dá)降低和內(nèi)酯素、抵抗素的表達(dá)明顯升高，影響了正常的血糖調(diào)節(jié)機(jī)制,導(dǎo)致FBG明顯升高?？梢钥闯?，PPAR-γ與脂肪因子的表達(dá)有著明顯的一致性。FK506可以通過(guò)抑制PPAR-γ的表達(dá)，影響脂肪因子的分泌，誘導(dǎo)糖耐受損傷。

研究表明，leptin的表達(dá)與胰島素的抵抗呈正向關(guān)系[14]，高濃度的leptin可能會(huì)抑制脂肪細(xì)胞PPAR-γ的表達(dá)[15-16]。這可能是與島素的抵抗程度及研究的組織有關(guān)系，也說(shuō)明PPAR-γ及l(fā)eptin之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Montori VM, Basu A, Erwin PJ, et al. Posttransplantation diabetes: a systematic review of the literature[J]. Diabetes Care, 2002, 25(3):583-592.

[2] Roland M, Gatault P, Doute C, et al. Immunosuppressive medications, clinical and metabolic parameters in new-onset diabetes mellitus after kidney transplantation[J]. Transpl Int, 2008, 21(6):523-530.

[3] Chien YS, Chen YT, Chuang CH, et al. Incidence and risk factors of new-onset diabetes mellitus after renal transplantation[J]. Transplant Proc, 2008, 40(7):2409-2411.

[4] Sahay M, Sahay RK, Narayan G, et al. New-onset diabetes after transplantation - Role of oral glucose tolerance test for diagnosis and study of risk factors[J]. Saudi J Kidney Dis Transpl, 2013, 24(5):897-902.

[5] 王 振，石炳毅，鄭慧麗，等. 腎移植術(shù)后糖尿病的發(fā)病機(jī)制[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31(3)：292-295.

[6] Heit JJ, Apelqvist AA, Gu X, et al. Calcineurin/NFAT signalling regulates pancreatic beta-cell growth and function[J]. Nature, 2006, 443(7109):345-349.

[7] Holowachuk EW. Nuclear factor of activated T cell (NFAT) transcription proteins regulate genes involved in adipocyte metabolism and lipolysis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 361(2): 427-432.

[8] Hernandez-Fisac I, Pizarro-Delgado J, Calle C, et al. Tacrolimus-induced diabetes in rats courses with suppressed insulin gene expression in pancreatic islets[J]. Am J Transplant, 2007, 7(11):2455-2462.

[9] Terauchi Y, Kadowaki T. PPAR and diabetes[J]. Nihon Rinsho, 2005, 63(4): 623-629.

[10] Yadav A, Kataria MA, Saini V, et al. Role of leptin and adiponectin in insulin resistance[J]. Clin Chim Acta, 2013, 417:80-84.

[11] Bayes B, Lauzurica R, Granada ML, et al. Adiponectin and risk of new-onset diabetes mellitus after kidney transplantation[J]. Transplantation, 2004, 78(1): 26-30.

[12] Chen L, He T, Han Y, et al. Pentamethylquercetin improves adiponectin expression in differentiated 3T3-L1 cells via a mechanism that implicates PPARgamma together with TNF-alpha and IL-6[J]. Molecules, 2011, 16(7): 5754-5768.

[13] Bastard JP, Hainque B, Dusserre E, et al. Peroxisome proliferator activated receptor-gamma, leptin and tumor necrosis factor-alpha mRNA expression during very low calorie diet in subcutaneous adipose tissue in obese women[J]. Diabetes Metab Res Rev, 1999, 15(2): 92-98.

[14] Silha JV, Krsek M, Skrha JV, et al. Plasma resistin, adiponectin and leptin levels in lean and obese subjects: correlations with insulin resistance[J]. Eur J Endocrinol, 2003, 149(4):331-335.

[15] Rhee SD, Sung YY, Jung WH, et al. Leptin inhibits rosiglitazone-induced adipogenesis in murine primary adipocytes[J]. Mol Cell Endocrinol, 2008, 294(1-2): 61-69.

[16] Cabrero A, Cubero M, Llaverias G, et al. Leptin down-regulates peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-gamma) mRNA levels in primary human monocyte-derived macrophages[J]. Mol Cell Biochem, 2005, 275(1-2):173-179.