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    降脂1號(hào)對(duì)高脂血癥模型大鼠小腸及Caco-2細(xì)胞膽固醇代謝的影響

    2022-09-29 02:23:02潘秋閆玉冰田聰陽張志清于彤柴欣樓楊然
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2022年9期
    關(guān)鍵詞:降脂小腸膽固醇

    潘秋,閆玉冰,田聰陽,張志清,于彤,柴欣樓,楊然

    1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,北京 100029;2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院,北京 100091;3.中國醫(yī)科大學(xué)航空總醫(yī)院,北京 100012;4.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京100053

    高血脂引發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病等成為老年人致死的主要原因,膽固醇作為脂代謝過程的重要部分,被認(rèn)為是疾病進(jìn)展的重要影響因素,降膽固醇藥物的研究是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題之一。迄今為止,批準(zhǔn)上市的抑制膽固醇吸收藥物只有依折麥布,其與他汀類藥物聯(lián)合應(yīng)用相比單一使用他汀類藥物可以更好地降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平,但藥物聯(lián)用往往會(huì)增加肝功能損傷及肌痛等不良反應(yīng)發(fā)生率。

    降脂1號(hào)是本課題組從名老中醫(yī)郭維琴臨床經(jīng)驗(yàn)方中提煉的處方,具有活血消食、祛濕健脾功效,臨床用于治療高膽固醇血癥,但其具體作用機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)采用高脂乳劑誘導(dǎo)建立高脂血癥大鼠模型及Caco-2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積模型,以小腸為切入點(diǎn),從膽固醇攝取及排出2個(gè)環(huán)節(jié)探討其作用機(jī)制,為降脂1號(hào)的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物及細(xì)胞

    8 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠48 只,體質(zhì)量(180±20)g,斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010。常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物房,(溫度22±2)℃、12 h明暗交替,自由進(jìn)食飲水,使用許可證號(hào)SYXK(京)2019-0010。本實(shí)驗(yàn)由北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞株購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

    1.2 藥物及制備

    降脂1號(hào)顆粒由中日友好醫(yī)院制劑室提供,灌胃前用去離子水稀釋溶解;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前用去離子水稀釋,并于超凈工作臺(tái)內(nèi)用0.22 μm濾膜過濾除菌分裝,-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。阿托伐他汀片,輝瑞制藥有限公司,批號(hào)20140326,20 mg/片,將藥片粉碎,使用蒸餾水溶解,制成濃度為1.05 mg/mL溶液。丙硫氧嘧啶片,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)1021045,50 mg/片。依折麥布片,默沙東(中國)有限公司,批號(hào)20160181,10 mg/片。

    1.3 主要試劑與儀器

    ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G5(ABCG5)兔多克隆抗體(美國Proteintech 公司,批號(hào)27722-1-AP),NPC1L1多克隆抗體(美國Thermo公司,批號(hào)PA1-16800),超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào)PV-9002),DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào)ZLI-9018),DAPI染色液(北京Solarbio,批號(hào)C0065)。120全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝),D-37520 高速離心機(jī)(德國Sigma),RM2235切片機(jī)(德國Leica),G1150H石蠟包埋機(jī)(德國Leica),CJT-E-Ⅱ超凈工作臺(tái)(北京市昌平長城空氣凈化設(shè)備公司)。

    1.4 分組、造模及給藥

    大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后開始實(shí)驗(yàn),48只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、阿托伐他汀組和降脂1號(hào)低、中、高劑量組,每組8只。高脂乳劑按照課題組前期方法配制:豬油30 g、膽固醇5 g、蛋黃粉5 g、丙硫氧嘧啶0.5 g、吐溫-80 4 mL,加蒸餾水定容至100 mL,80 ℃水浴攪拌充分溶解形成高脂乳劑。對(duì)照組予蒸餾水灌胃,其余各組每日固定時(shí)間按2 mL/kg予高脂乳劑灌胃,共6周。造模第2周開始給藥,給藥劑量按人與大鼠體表面積進(jìn)行計(jì)算,降脂1號(hào)低、中、高劑量組分別為0.37、1.1、3.3 g/kg(相當(dāng)于臨床等效劑量的1/3、1、3倍),阿托伐他汀組為2.1 mg/kg,灌胃體積2 mL/kg,每日1次,連續(xù)6周。

    1.5 取材

    末次給藥結(jié)束后大鼠禁食不禁水12 h,稱量體質(zhì)量,10%水合氯醛腹腔注射(5 mL/kg)麻醉,腹主動(dòng)脈取血,用于血脂及肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)。取小腸組織,預(yù)冷生理鹽水沖凈,迅速置于4%多聚甲醛中固定。

    1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

    Caco-2 細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞(約第5日),加入胰酶消化,1 000 r/min離心5 min,棄上清,沉淀加完全培養(yǎng)基重懸,細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×10~1×10個(gè)/mL,將細(xì)胞懸液接種至12孔Transwell板,每孔接種細(xì)胞1×10個(gè),加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng),接種后第1周隔日更換培養(yǎng)基,1周后每日更換培養(yǎng)基,至第21日細(xì)胞分化成熟,將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、依折麥布組和降脂1號(hào)低、中、高濃度組。

    1.7 細(xì)胞造模與給藥

    對(duì)照組細(xì)胞用不含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng),模型組細(xì)胞用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng),依折麥布組和降脂1號(hào)低、中、高濃度組分別在模型組基礎(chǔ)上加入依折麥布和低、中、高濃度降脂1號(hào)同時(shí)處理24 h。根據(jù)CCK8預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,降脂1號(hào)低、中、高濃度分別為0.3、0.6、1.2 mg/mL,依折麥布濃度為50 μmol/L。

    1.8 指標(biāo)檢測(cè)

    1.8.1 一般情況

    每日觀察大鼠毛色、狀態(tài),每周測(cè)量大鼠體質(zhì)量。

    1.8.2 血脂及肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)

    采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平,本實(shí)驗(yàn)由北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院完成。

    1.8.3 HE染色

    將固定后的小腸組織從4%多聚甲醛中取出,蒸餾水沖洗過夜,脫水機(jī)梯度脫水,石蠟包埋,切片(5 μm),常規(guī)HE染色,光鏡下觀察小腸組織病理變化。

    1.8.4 免疫組化檢測(cè)

    小腸組織石蠟切片脫蠟至水,微波爐加熱修復(fù)抗原,流水沖洗,10%山羊血清室溫孵育30 min,滴加ABCG5 一抗(1∶500)、NPC1L1 一抗(1∶100),37 ℃孵育1 h,滴加二抗,室溫孵育30 min,全自動(dòng)封片機(jī)封片,光學(xué)顯微鏡下觀察,以棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。應(yīng)用ImageJ1.53e圖像分析軟件,根據(jù)陽性染色面積和強(qiáng)度計(jì)算平均光密度(MOD)。MOD=積分光密度÷染色面積。

    1.8.5 免疫熒光檢測(cè)

    用6孔板制作細(xì)胞爬片,造模及加藥處理后,收集細(xì)胞,將Caco-2 細(xì)胞懸液滴至爬片上,放入37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,滴加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞完全貼滿爬片時(shí),取出細(xì)胞爬片放入細(xì)胞培養(yǎng)皿,加入4%多聚甲醛室溫固定,分別滴加ABCG5 一抗(1∶200)、NPC1L1 一抗(1∶100),4 ℃孵育過夜,滴加熒光二抗,室溫孵育1 h,DAPI復(fù)染,封片,共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。應(yīng)用Image J 1.53e圖像分析軟件,計(jì)算平均熒光強(qiáng)度(累計(jì)熒光強(qiáng)度÷染色面積)。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 降脂1號(hào)對(duì)模型大鼠一般情況的影響

    對(duì)照組大鼠毛色潔凈有光澤,行動(dòng)靈活,精神狀態(tài)良好,體質(zhì)量有所增加;模型組大鼠毛色干黃無澤,活動(dòng)減少,形體逐漸消瘦;阿托伐他汀組大鼠形體更加消瘦;降脂1號(hào)低、中、高劑量組大鼠毛色黃而少澤,形體消瘦有所好轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)過程中,因麻醉過量及灌胃不當(dāng),共有14只大鼠死亡。

    2.2 降脂1號(hào)對(duì)模型大鼠血脂及肝腎功能指標(biāo)的影響

    血脂檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠TC、LDL-C水平明顯升高(<0.01);與模型組比較,阿托伐他汀組與降脂1號(hào)各劑量組大鼠TC、LDL-C水平明顯降低(<0.05,<0.01)。各組大鼠TG、HDL-C差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。見表1。

    表1 各組大鼠血脂水平比較(,mmol/L)

    肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠ALT、BUN、SCr水平明顯升高(<0.01);與模型組比較,降脂1號(hào)高劑量組大鼠ALT水平明顯降低(<0.05),降脂1號(hào)中、高劑量組大鼠BUN水平明顯降低(<0.01),阿托伐他汀組和降脂1號(hào)低、高劑量組大鼠SCr水平明顯降低(<0.01)。各組大鼠AST差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。見表2。

    表2 各組大鼠肝腎功能指標(biāo)比較()

    2.3 降脂1號(hào)對(duì)模型大鼠小腸組織病理變化的影響

    對(duì)照組大鼠小腸肌層完整,上皮隱窩及絨毛排列整齊,刷狀緣整齊;模型組大鼠小腸局部肌層較薄,相鄰絨毛融合,間隙變寬,排列疏松有缺失,部分腺體碎裂;阿托伐他汀組大鼠小腸相鄰絨毛融合變寬,排列疏松有缺失,部分腺體碎裂;降脂1號(hào)低、中劑量組大鼠小腸絨毛排列較模型組和阿托伐他汀組緊密、規(guī)則,絨毛高度有所恢復(fù),相鄰絨毛融合較少;降脂1號(hào)高劑量組大鼠小腸相鄰絨毛部分融合,排列略疏松,部分上皮細(xì)胞脫落,部分腺體碎裂。見圖1。

    圖1 各組大鼠小腸組織形態(tài)(HE染色,×20)

    2.4 降脂1 號(hào)對(duì)模型大鼠小腸組織ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G5、NPC1L1表達(dá)的影響

    與對(duì)照組比較,模型組大鼠小腸組織ABCG5表達(dá)降低,NPC1L1表達(dá)升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05);與模型組比較,降脂1號(hào)低劑量組大鼠小腸組織NPC1L1表達(dá)明顯降低(<0.05),降脂1號(hào)各劑量組大鼠小腸組織ABCG5表達(dá)升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。見圖2、圖3、表3。

    表3 各組大鼠小腸組織ABCG5、NPC1L1蛋白表達(dá)比較[M(Q1,Q3),MOD]

    圖2 各組大鼠小腸組織ABCG5陽性表達(dá)(免疫組化染色,×20)

    圖3 各組大鼠小腸組織NPC1L1陽性表達(dá)(免疫組化染色,×20)

    2.5 降脂1號(hào)對(duì)Caco-2細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G5、NPC1L1蛋白表達(dá)的影響

    與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞ABCG5、NPC1L1表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05);與模型組比較,降脂1號(hào)高濃度組細(xì)胞ABCG5表達(dá)明顯升高,NPC1L1表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05,<0.01),見圖4、圖5、表4。

    圖4 各組Caco-2細(xì)胞ABCG5陽性表達(dá)(免疫熒光染色,×20)

    圖5 各組Caco-2細(xì)胞NPC1L1陽性表達(dá)(免疫熒光染色,×20)

    表4 各組Caco-2細(xì)胞ABCG5、NPC1L1蛋白表達(dá)比較(,平均熒光強(qiáng)度)

    3 討論

    LDL-C和TC水平升高是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病重要的危險(xiǎn)因素。中藥復(fù)方可以通過多組分、多靶點(diǎn)、多通路干預(yù)血脂代謝,從而實(shí)現(xiàn)安全有效調(diào)脂的目的。本課題組以小腸膽固醇代謝為切入點(diǎn),發(fā)現(xiàn)降脂1號(hào)可有效降低高脂血癥大鼠血脂水平,并且具有良好的肝腎保護(hù)作用,可明顯改善小腸病變程度,恢復(fù)小腸吸收、排出膽固醇平衡,從而達(dá)到有效降脂的目的。

    本實(shí)驗(yàn)過程中模型組及給藥組大鼠體質(zhì)量增長緩慢,丙硫氧嘧啶可明顯減少大鼠進(jìn)食量和體質(zhì)量,灌胃高脂乳劑后進(jìn)食量進(jìn)一步減少,而體質(zhì)量可小幅回升。有報(bào)道,給予大鼠0.2%丙硫氧嘧啶灌胃可導(dǎo)致LDL-C、TC、TG、HDL-C水平升高,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全一致,考慮可能是本實(shí)驗(yàn)配制的丙硫氧嘧啶濃度偏高,對(duì)甲狀腺抑制作用更明顯,大鼠進(jìn)食及消化功能明顯趨緩,脂質(zhì)代謝受到影響,TG水平不升反降。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),降脂1號(hào)各劑量組大鼠體質(zhì)量可緩慢增加,推測(cè)可能與降脂1號(hào)緩解丙硫氧嘧啶所致大鼠甲狀腺功能減退有關(guān)。

    小腸在脂類代謝過程中與肝臟協(xié)同分工發(fā)揮作用。HE染色發(fā)現(xiàn),模型大鼠小腸組織明顯損傷,小腸相鄰絨毛融合,間隙變寬,排列疏松,部分腺體碎裂。降脂1號(hào)可顯著改善小腸病理形態(tài),為發(fā)揮降脂作用提供必要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

    NPC1L1在多個(gè)組織中廣泛表達(dá),尤其在肝臟和小腸中高表達(dá)。NPC1L1能促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞攝取膽固醇,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量降低時(shí),NPC1L1將移動(dòng)至細(xì)胞膜側(cè),參與胞外膽固醇攝取進(jìn)入細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),降脂1號(hào)能降低模型大鼠小腸組織NPC1L1蛋白表達(dá),其中低劑量組效果最明顯,說明減少小腸吸收膽固醇是降脂1號(hào)發(fā)揮降脂作用的重要環(huán)節(jié)之一。ABCG5/G8 屬于ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白半轉(zhuǎn)運(yùn)體,ABCG5/G8結(jié)合成異二聚體,其主要功能是將被攝取進(jìn)入小腸上皮細(xì)胞的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)回腸腔。本實(shí)驗(yàn)中,雖然各組大鼠小腸組織ABCG5蛋白表達(dá)無明顯差異,但降脂1號(hào)各劑量組ABCG5蛋白表達(dá)均有升高趨勢(shì),其中低劑量組最明顯,提示降脂1號(hào)可促進(jìn)小腸排出膽固醇,降低血脂水平。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,降脂1號(hào)高濃度組細(xì)胞ABCG5表達(dá)明顯降低,與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。我們認(rèn)為,這可能與大鼠實(shí)驗(yàn)采用丙硫氧嘧啶灌胃有關(guān)。研究表明,臨床或亞臨床甲狀腺功能減退可顯著改變血脂水平,多數(shù)高脂血癥患者伴有甲狀腺功能障礙。提示甲狀腺功能減退可能影響大鼠腸道膽固醇代謝功能,進(jìn)而導(dǎo)致膽固醇流出受損。

    經(jīng)腸膽固醇排泄(TICE)是小腸的另一種外排機(jī)制,即膽固醇由血直接經(jīng)腸道分泌和排出體外。有研究表明,依折麥布誘導(dǎo)的TICE大多由ABCG5/G8介導(dǎo),TICE在人體中很活躍,可能是刺激心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)患者消除膽固醇的新靶點(diǎn)。課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),肝臟在膽固醇攝取及流出方面亦發(fā)揮積極作用,本實(shí)驗(yàn)中各給藥組大鼠血清膽固醇水平明顯下降,我們推測(cè)肝臟在調(diào)節(jié)膽固醇代謝方面的正向作用減輕了腸道ABCG5/G8外排膽固醇的負(fù)擔(dān),但需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

    綜上所述,降脂1號(hào)能夠降低高脂血癥大鼠血脂水平,低劑量用藥即可減輕小腸病理損傷,推測(cè)其機(jī)制可能與抑制小腸膽固醇吸收、促進(jìn)小腸膽固醇排出有關(guān),其內(nèi)在的相互作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究為指導(dǎo)臨床用藥及藥物進(jìn)一步開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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