原生質(zhì)體誘變提高亞麻刺盤孢ST對底物DHEA的 耐受性和轉(zhuǎn)化率

李恒，吳燕，魏利莎，李會，張曉梅，史勁松，許正宏

（江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

屈螺酮是一種高效、低毒、無副作用的新一代女用口服避孕藥[1]。由于屈螺酮具有廣闊的市場應(yīng)用前景，其重要的前體化合物三羥基雄甾烯酮（7α，15α-diOH-DHEA）受到了廣泛的關(guān)注。目前，7α，15α-diOH-DHEA的主要生產(chǎn)方法是化學(xué)合成法，存在反應(yīng)步驟繁瑣、產(chǎn)物得率低、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題。20世紀(jì)70年代，德國先令公司（Schering AG）首次將生物轉(zhuǎn)化法應(yīng)用于屈螺酮的合成研究，利用微生物的羥化酶系統(tǒng)，在去氫表雄酮（DHEA）的C7、C15位雙羥化得到7α,15α-diOH-DHEA，但轉(zhuǎn)化率一直比較低，限制了其大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用。目前對DHEA具有轉(zhuǎn)化能力的菌株主要來自Mucorracemosus、Fusarium moniliforme和Colletotrichumlini這幾個菌屬，其中以C. lini的催化活性最為顯著[2-3]。但高濃度的DHEA對C. lini具有明顯的毒害作用，因此，如何提高菌株底物耐受性，是實現(xiàn)高底物投料濃度和高轉(zhuǎn)化效率必須要解決的一個 問題。

由于C. lini的遺傳背景不清晰，因此非理性誘變育種是提高C. lini底物耐受性的首選。但絲狀真菌細(xì)胞壁成分復(fù)雜，直接以孢子或菌絲體為誘變對象，誘變劑很難直接接觸其遺傳物質(zhì)，造成突變率低且陽性突變株較少。自1953年Weibull首次用溶菌酶酶解分離到Bacillus megaterium的原生質(zhì)體之后，更多的研究人員開始利用原生質(zhì)體誘變技術(shù)選育菌種，已有利用原生質(zhì)體誘變選育高產(chǎn)菌株的 實例[4-7]。

本研究以實驗室保存的Colletotrichum liniST為出發(fā)菌株，研究其原生質(zhì)體的制備和再生方法后，利用等離子誘變（ARTP）處理原生質(zhì)體。通過抗性平板初篩和HPLC復(fù)篩，最終獲得了一株遺傳穩(wěn)定性良好、底物耐受性較高的優(yōu)勢突變菌株，并考察了其轉(zhuǎn)化特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

亞麻刺盤孢ST，由本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 15，酵母粉 15，玉米漿 3。種子培養(yǎng)基加10g/L豆餅粉。

PDA培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂 20。

再生培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂 5，滲透壓穩(wěn)定劑，在最佳培養(yǎng)條件研究時，組分及濃度進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

FM培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 15，酵母粉 15，玉米漿 3，瓊脂5。

査氏培養(yǎng)基（g/L）：NaNO33，K2HPO41，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01， 蔗糖 30，瓊脂 8。

1.1.3 試劑

DHEA、7α,15α-diOH-DHEA標(biāo)準(zhǔn)品，購自浙江仙居君業(yè)藥業(yè)有限公司；7α-OH-DHEA標(biāo)準(zhǔn)品由本實驗室分離制備；纖維素酶、蝸牛酶、溶菌酶均購自上海生物工程公司；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌絲體的收集

將PDA斜面保存的亞麻刺盤孢菌絲體接種于無菌種子培養(yǎng)基，30℃、220r/min條件下培養(yǎng)24h，隨后以10%的接種量接入30mL/250mL發(fā)酵培養(yǎng)基，同樣條件下培養(yǎng)至對數(shù)期，12000r/min離心10min收集菌絲體，用于后續(xù)原生質(zhì)體的制備。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備與再生

將收集的對數(shù)期菌絲體用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌離心一次，加入適量的酶解液于水浴鍋中酶解。過濾除菌體碎片后，酶解液離心棄上清，原生質(zhì)體用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2次，重懸于1mL滲透壓穩(wěn)定劑中。制備的原生質(zhì)體稀釋104倍數(shù)后，采用傾倒法再生，其再生率計算如式（1）。

1.2.3 原生質(zhì)體釋放過程

原生質(zhì)體稀釋一定的倍數(shù)后，利用血球計數(shù)法計數(shù)。酶解過程每隔0.5h取樣，于顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的形態(tài)及釋放過程。

1.2.4 原生質(zhì)體誘變與優(yōu)勢突變株的篩選

C. liniST原生質(zhì)體經(jīng)ARTP照射后進(jìn)行再生培養(yǎng)，以不經(jīng)誘變的原生質(zhì)體作為對照，計算誘變致死率，如式（2）。同時以底物濃度梯度為篩子進(jìn)行抗性平板篩選，以不含底物的平板作為對照，計算底物致死率，如式（3）。從含有高濃度底物的抗性平板中挑取單菌落發(fā)酵培養(yǎng)后轉(zhuǎn)化DHEA，測定7α，15α-diOH-DHEA得率，篩選優(yōu)勢突變株并保種。

1.2.6 突變株的評價

遺傳穩(wěn)定性考察：將突變株進(jìn)行連續(xù)傳代，測定產(chǎn)物7α,15α-diOH-DHEA得率，并以第一代為對照進(jìn)行比較。

底物耐受性考察：將突變菌株與出發(fā)菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的DHEA繼續(xù)培養(yǎng)24h。取1mL培養(yǎng)液過濾獲得孢子，稀釋一定倍數(shù)后涂布于PDA培養(yǎng)基，根據(jù)再生單菌落數(shù)計算菌體對DHEA的耐受性。其計算方法如 式（4）。

轉(zhuǎn)化過程分析：將種子液按10%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，220r/min、30℃培養(yǎng)24h。隨后向發(fā)酵液中投入10g/L DHEA，繼續(xù)轉(zhuǎn)化72h，測定轉(zhuǎn)化過程曲線。

1.2.7 分析方法

采用高效液相色譜法（HPLC）檢測DHEA、7α-OH-DHEA、7α,15α-diOH-DHEA的濃度。色譜柱，Agilent TC-C18 （4.6mm×250mm，5μm）；流動相，乙腈/水（7∶3，體積比）；柱溫30℃；檢測波長206nm；流速0.5mL/min；進(jìn)樣量10μL。產(chǎn)物得率計算方法如式（5）。

式中，C1為HPLC檢測的7α,15α-diOH-DHEA濃度；C2為HPLC檢測的DHEA濃度。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備

2.1.1 酶濃度對原生質(zhì)體制備的影響

不同種類微生物在制備原生質(zhì)體時所需酶的種類和濃度不同。絲狀真菌細(xì)胞壁的主要成分是多糖、蛋白質(zhì)和脂類。文獻(xiàn)報道蝸牛酶、纖維素酶、溶壁酶這3種酶均可用于制備霉菌原生質(zhì)體[8]，采用這3種酶制備C. liniST原生質(zhì)體結(jié)果如表1所示。由表1可知，采用纖維素酶5mg/mL，蝸牛酶4mg/mL，溶菌酶1mg/mL的酶組合時原生質(zhì)體的制備率最高，為1.19×108個/mL。另外，從表1還可以看出，在制備C. liniST原生質(zhì)體時，溶菌酶的濃度對制備 率的影響非常小，而纖維素酶和蝸牛酶的濃度對制備率影響比較大，說明C. liniST的細(xì)胞壁主要是由纖維素和幾丁質(zhì)構(gòu)成，而由溶菌酶降解的葡聚糖含量相對較低。

表1 不同酶組合對菌株原生質(zhì)體形成數(shù)量的影響

2.1.2 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響

在制備原生質(zhì)體的過程中，酶解時間過短或過長都會顯著影響原生質(zhì)體的制備率。圖1顯示，C. liniST原生質(zhì)體的制備率隨著酶解時間的延長而增加，2.5h時制備率達(dá)到最高，為2.14×108個/mL。這可能是因為酶解時間過短，菌體脫壁不完全，原生質(zhì)體不能完全釋放，造成其制備率偏低；而酶解時間過長，酶解液中某些物質(zhì)對早期釋放的原生質(zhì)體細(xì)胞膜有破壞作用，加之原生質(zhì)體細(xì)胞膜本身的不穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致原生質(zhì)體制備率急速下降。因此，酶解時間以2.5h最為適宜。

2.1.3 酶解溫度對原生質(zhì)體制備的影響

圖1 不同酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響

圖2 不同酶解溫度對原生質(zhì)體制備的影響

不同的裂解酶在不同的溫度下其活性不同，進(jìn)而影響原生質(zhì)體的制備率。分別在30℃、32℃、 34℃、36℃制備C. liniST原生質(zhì)體，結(jié)果如圖2 所示。由圖2可見，原生質(zhì)體的制備率在32℃時達(dá)到最高，為2.22×108個/mL，而后隨著溫度的升高制備率降低。因此，后續(xù)實驗以32℃作為C. liniST原生質(zhì)體最適酶解溫度。

2.2 原生質(zhì)體的釋放

將裂解酶加入菌絲體酶解體系，經(jīng)過酶解反應(yīng)后，在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的釋放過程。由圖3可知，隨著酶解時間的延長，菌絲體逐漸減少，原生質(zhì)體的數(shù)量逐漸增多。當(dāng)酶解0.5h時，反應(yīng)液中存在大量完整未被破壞的菌絲體，而當(dāng)酶解時間達(dá)到2.5h時，菌絲體幾乎完全裂解，并釋放出大量的原生質(zhì)體。另外，從圖3(c)可看出，C. liniST原生質(zhì)體多呈球形，中間一般含有一個液泡，其余的內(nèi)含物呈月牙狀，透明性較液泡差。這與相關(guān)文獻(xiàn)報道的原生質(zhì)體釋放過程相一致[9]。

2.3 原生質(zhì)體的再生

圖3 C. lini ST原生質(zhì)體釋放過程

圖4 不同培養(yǎng)基成分對原生質(zhì)體再生的影響

適宜的培養(yǎng)基是保證原生質(zhì)體進(jìn)行再生重要因素之一。在C. liniST菌絲體固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上， 添加適量的滲透壓穩(wěn)定劑及營養(yǎng)因子，考察不同培養(yǎng)基對C. liniST原生質(zhì)體再生率的影響。如圖4所示，在4種PDA培養(yǎng)基中，原生質(zhì)體的再生能力基本一致，補(bǔ)加酵母膏的再生率略高，再生率為9.48%。與之相比，C. liniST原生質(zhì)體在査氏高滲和FM高滲培養(yǎng)基的再生率較低，推測可能是PDA培養(yǎng)基中的土豆浸出液可作為細(xì)胞壁合成的前體物質(zhì)，也可能通過代謝轉(zhuǎn)化成細(xì)胞壁的前體物質(zhì)或起到促進(jìn)代謝，加速細(xì)胞壁合成的作用。

2.4 原生質(zhì)體等離子誘變

將C. liniST原生質(zhì)體經(jīng)ARTP照射不同時間后進(jìn)行再生培養(yǎng)，根據(jù)再生單菌落計算其致死率，結(jié)果見圖5。隨著ARTP誘變時間的延長，原生質(zhì)體致死率迅速增加。當(dāng)照射時間為120s時，原生質(zhì)體致死率達(dá)到95%左右。等離子誘變在致死率較高時比較易發(fā)生正向突變，故選擇120s作為原生質(zhì)體的處理時間。

2.5 突變株的選育

圖5 不同誘變時間原生質(zhì)體致死率

圖6 不同DHEA濃度原生質(zhì)體的致死率

原生質(zhì)體經(jīng)ARTP誘變處理后，以DHEA的濃度為篩子進(jìn)行抗性平板篩選，DHEA對原生質(zhì)體的致死率如圖6所示。當(dāng)DHEA的濃度為4g/L時， 致死率為32.8%；當(dāng)DHEA濃度為12g/L時，致死率迅速增加到92.4%；當(dāng)DHEA濃度為18g/L時，原生質(zhì)體致死率已接近100%。由此可見，C. liniST原生質(zhì)體的致死率在DHEA濃度為12～14g/L時易發(fā)生正向突變，選擇14g/L DHEA的平板進(jìn)行陽性突變株的初篩。

從抗性平板的單菌落中挑取60株突變株，轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，投入10g/L的DHEA轉(zhuǎn)化72h，測定各突變株的7α，15α-diOH-DHEA得率。如圖7所示，通過搖瓶轉(zhuǎn)化實驗驗證，最終獲得了6株產(chǎn)物得率有較大提高的菌株y-1、y-4、y-14、y-15、y-19和y-45。

2.6 突變株遺傳穩(wěn)定性考察

將6株突變株分別進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以考察其遺傳穩(wěn)定性。如圖8所示，經(jīng)過連續(xù)5代的培養(yǎng)，得到了一株轉(zhuǎn)化率高且穩(wěn)定的菌株，命名為C. liniST-0317。其在DHEA濃度為10g/L的條件下，經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)，7α,15α-diOH-DHEA的得率為36.5%～38.0%。

2.7 突菌株ST-0317底物耐受性

圖7 突變菌株篩選

圖8 突變株ST-0317的遺傳穩(wěn)定性

圖9 出發(fā)菌株與優(yōu)勢菌株菌體活性的比較

以出發(fā)菌株ST作為對照，考察ST-0317對不 同濃度DHEA的耐受性。由圖9可以看出，在DHEA濃度低于4g/L時，DHEA對菌體的毒害作用比較小，ST與ST-0317對底物的耐受性相差不大。但當(dāng)DHEA濃度超過6g/L時，菌株ST-0317對DHEA的耐受性有顯著提高。當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)18g/L時，菌株ST-0317仍能保持62.4%的催化活性，而菌株ST已低于20%。由此可見，突變株ST-0317對高濃度底物的耐受性顯著高于出發(fā)菌株ST。

2.8 突菌株ST-0317轉(zhuǎn)化過程分析

將出發(fā)菌株ST、突變株ST-0317分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，投入10g/L的DHEA，測定轉(zhuǎn)化過程曲線，結(jié)果如圖10所示。在前24h，菌株ST和ST-0317的雙羥產(chǎn)物得率均比較低。隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，出發(fā)菌株ST在72h時產(chǎn)物得率達(dá)到最高，為24.6%。而突變株ST-0317的轉(zhuǎn)化速率明顯高于出發(fā)菌株，在轉(zhuǎn)化60h后，7α,15α-diOH- DHEA的得率可達(dá)到36.9%，比ST提高了50%。同時，ST-0317的轉(zhuǎn)化周期也由72h縮短至60h。結(jié)果說明突變株ST-0317經(jīng)等離子誘變后不但提高了對高濃度底物的耐受性，而且提高了其對DHEA的轉(zhuǎn)化率。

圖10 菌株ST和ST-0317的轉(zhuǎn)化過程曲線

3 結(jié) 論

以C. liniST作為出發(fā)菌株制備原生質(zhì)體，確定了C. liniST原生質(zhì)體制備及再生的最佳條件。原生質(zhì)體經(jīng)ARTP誘變后，獲得一株底物耐受性高且7α，15α-diOH-DHEA產(chǎn)量顯著提高的突變株ST-0317。對其轉(zhuǎn)化特性進(jìn)行分析，在DHEA濃度為10g/L的條件下，ST-0317的7α,15α-diOH-DHEA得率為36.9%，比出發(fā)菌株提高50%，同時轉(zhuǎn)化周期由72h縮短至60h。

原生質(zhì)體誘變技術(shù)在提高C. liniST底物耐受性及轉(zhuǎn)化率上取得了良好的效果，突菌株C. liniST-0317預(yù)期在經(jīng)過發(fā)酵和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化后，其轉(zhuǎn)化能力會有更大幅度的提高。

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