癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖3單克隆抗體的制備及應(yīng)用*

王玉亮 劉 濤 穆 紅

癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖3單克隆抗體的制備及應(yīng)用*

王玉亮 劉 濤 穆 紅△

目的制備抗癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）單克隆抗體，并初步應(yīng)用。方法利用PCR方法，將GPC3基因重組到原核表達載體pET16b中，在大腸桿菌中表達，純化后的GPC3融合蛋白對Balb/c小鼠脾內(nèi)包埋免疫，取小鼠脾細胞與Sp2/0細胞進行細胞融合，應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和Western blot法篩選及鑒定分泌特異性抗GPC3單克隆抗體的雜交瘤細胞株，間接免疫熒光檢測肝癌細胞中GPC3表達。結(jié)果成功構(gòu)建了GPC3原核表達載體，在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達重組GPC3蛋白。應(yīng)用單克隆抗體雜交瘤技術(shù)成功制備1株穩(wěn)定分泌抗GPC3單克隆抗體的雜交瘤細胞株，通過Western blot鑒定具有高度的特異性，間接免疫熒光實驗顯示單克隆抗體能與HepG2細胞內(nèi)GPC3特異性結(jié)合。結(jié)論成功制備出特異性抗人GPC3單克隆抗體。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖類；抗體,單克??；重組融合蛋白質(zhì)類；雜交瘤；細胞系；癌,肝細胞；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；單克隆抗體

癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）屬于硫酸乙酰肝素類蛋白聚糖家族中的一員，其基因位于人染色體Xq26，由8個外顯子組成，cDNA全長2 263 bp，編碼580個氨基酸[1]。研究顯示，GPC3是一個潛在的肝癌診斷及預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)的分子標(biāo)志物[2]。為此，筆者擬構(gòu)建GPC3原核表達載體，通過大腸桿菌表達GPC3蛋白，并以此為抗原制備抗人GPC3單克隆抗體，對其進行純化、鑒定，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用該抗體對肝癌細胞系表達GPC3進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細胞 SPF級雌性Balb/c小鼠，體質(zhì)量16～22 g，購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，動物許可證號：SCXK-（軍）2007-004，SPF動物飼養(yǎng)室恒溫飼養(yǎng)。骨髓瘤細胞Sp2/0、人肝癌細胞株HepG2由本室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 原核表達載體pET16b（Novagen公司，德國），質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒（天根生化科技有限公司），限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4連接酶（Fermentas公司，以色列），氨芐青霉素鈉（華美公司），RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清、HAT 、HT（Gibco公司，美國），聚乙二醇4000（默克公司，德國），小鼠IgG及亞類檢測試劑盒（Serotec公司，美國）。PCR擴增儀（Eppendorf公司，德國），數(shù)字化凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Innotech公司，美國），CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國），生物熒光顯微鏡（Olympus公司，日本），生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司），核酸蛋白分析儀（Beckman Coulter公司，美國），酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 GPC3表達載體的構(gòu)建 根據(jù)NCBI檢索的GPC3基因序列，設(shè)計GPC3擴增引物序列，上游5′-ACGGGATCCGCCAAGAACTACACCAATGC-3′（下劃線處為BamHⅠ酶切位點），下游 5′-ATTCTCGAGTTACTCCACCACACCTGCCATACA-3′（下劃線處為XhoⅠ酶切位點）。產(chǎn)物片段經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，連接到同樣酶切后pET16b載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Top 10 E.coli，重組質(zhì)粒酶切鑒定并測序。

1.2.2 重組GPC3蛋白誘導(dǎo)表達和純化 重組質(zhì)粒pET16b-GPC3轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21，挑取單個克隆菌落接種于含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；次日以1∶50的比例接種于相同培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達，于室溫繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白表達，進行親和層析純化。純化后的GPC3蛋白進行蛋白定量，以確定重組蛋白的濃度。

1.2.3 雜交瘤建株及腹水制備 Balb/c小鼠乙醚麻醉后脾臟內(nèi)置入1塊載有重組GPC3抗原的三角形硝酸纖維膜，使之完全包埋于脾臟內(nèi)。觀察無出血后回納脾臟。間隔3周后，用同樣方法再進行1次包埋，于取脾臟融合前3 d，腹腔注射重組GPC3抗原加強免疫。細胞融合具體方法參照文獻[3]，經(jīng)免疫的小鼠脾細胞與Sp2/0細胞融合后經(jīng)HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞株，陽性細胞株經(jīng)3次有限稀釋克隆，選取產(chǎn)生抗體滴度高的雜交瘤細胞，并按常規(guī)方法制備單克隆抗體腹水[3]。

1.2.4 單克隆抗體純化 采用飽和硫酸銨鹽析法純化抗體。

1.2.5 單克隆抗體的類別及亞類鑒定 采用小鼠IgG及亞類檢測試劑盒以間接ELISA法檢測。

1.2.6 雜交瘤細胞株染色體檢查 按常規(guī)核型分析方法進行雜交瘤細胞的染色體檢查。

1.2.7 單克隆抗體的免疫印跡分析 純化抗原經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，取下凝膠進行電轉(zhuǎn)移，電轉(zhuǎn)移完畢取出硝酸纖維膜，進行常規(guī)免疫測定。

1.2.8 間接免疫熒光染色 制備肝癌細胞株HepG2的細胞爬片后，以雜交瘤單克隆抗體的腹水作為一抗4℃過夜，PBS清洗，熒光二抗37℃孵育1 h，PBS清洗后置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 GPC3目的基因的酶切鑒定 GPC3目的基因經(jīng)雙酶切后，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示基因片段長度為500 bp左右，與預(yù)期片段大小相符，見圖1。酶切鑒定片段大小正確的質(zhì)粒經(jīng)Invitrogen公司測序，與GenBank中檢索GPC3 cDNA序列（Accession number:NM_001164617）100%同源，無堿基錯配和移碼突變，見圖2。

2.2 重組GPC3蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達 重組質(zhì)粒pET16b-GPC3轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21，IPTG誘導(dǎo)表達產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍染色觀察，含重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)菌在19 ku處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期大小基本相符，誘導(dǎo)表達成功，見圖3。經(jīng)過蛋白親和純化柱純化后，可得到純化的重組GPC3。

Figure 1 The agarose gel electrophoresis of GPC3 DNA by restriction enzyme digestion analysis圖1 GPC3基因片段酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure 3 The induction expression of GPC3 protein圖3 GPC3蛋白誘導(dǎo)表達

2.3 抗GPC3雜交瘤細胞的建株 免疫Balb/c小鼠脾細胞與Sp2/0細胞融合后，經(jīng)3次亞克隆，間接ELISA篩選后，獲得1株穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株。

2.4 染色體分析 對雜交瘤細胞株進行染色體分析，染色體數(shù)目均值為98，證實得到的細胞株基本上是小鼠脾細胞和Sp2/0細胞染色體數(shù)之和。

2.5 雜交瘤細胞分泌抗體類型的檢測結(jié)果 間接ELISA檢測單克隆抗體為IgG1亞型，κ輕鏈。

2.6 單克隆抗體的免疫印跡分析 免疫印跡顯示純化的單克隆抗體與分子質(zhì)量為19 ku的重組GPC3抗原分子有特異性反應(yīng)條帶，見圖4。

Figure 4 The identification of monoclonal antibody specificity by Western blot assay圖4 Western blot鑒定單克隆抗體的特異性

2.7 單克隆抗體間接免疫熒光染色 間接免疫熒光染色顯示單克隆抗體2F3與HepG2細胞呈陽性反應(yīng)，見圖5。

Figure 5 The indirect immunofluorescence staining of HepG2 cell line（×400）圖5 HepG2細胞間接免疫熒光染色（×400）

3 討論

肝細胞肝癌（HCC）是全世界最常見的惡性腫瘤之一，HCC的發(fā)病率位于全球惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，每年有超過50萬的新發(fā)病例，近100萬人死于該疾病，居腫瘤死亡原因的第3位，我國是HCC高發(fā)地區(qū)，其死亡率在消化道惡性腫瘤中排第3位，且近年來肝癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[4]。通過監(jiān)測肝癌患者腫瘤標(biāo)志物，可提早發(fā)現(xiàn)腫瘤或腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，提高預(yù)測和診斷的針對性，有利于完善患者治療方案，延長患者生存時間。國內(nèi)外最新研究表明，癌胚抗原GPC3作為一種分子標(biāo)志物在HCC的診斷、鑒別診斷方面具有重要臨床應(yīng)用價值[2,5]。Ishiguro[6]及 Ho等[7]研究顯示抗 GPC3 抗體具有抗肝癌作用。因此，制備針對GPC3的抗體對于肝癌臨床診斷和免疫治療具有重要的臨床意義。

本研究利用基因工程的方法，克隆GPC3蛋白部分原核表達載體，GPC3全蛋白大約70 ku，在之前的預(yù)實驗中，筆者已經(jīng)用一系列載體嘗試過表達GPC3全長或部分序列，根據(jù)實驗結(jié)果并考慮到表達的通暢、表達蛋白的免疫原性以及制備抗體的特異性和有效性，本研究選取了GPC3的中間510 bp序列進行GPC3原核表達載體的構(gòu)建，使得重組GPC3蛋白在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達，純化后的重組GPC3蛋白經(jīng)驗證，在19 ku處出現(xiàn)一條蛋白帶。本研究以重組GPC3蛋白作為抗原，對Balb/c小鼠脾內(nèi)包埋免疫，獲得良好的效果。此法相對其他方法而言具有周期短、免疫原性高、免疫效果好及抗原用量少等優(yōu)點。筆者通過經(jīng)典的單克隆抗體雜交瘤細胞融合技術(shù)，成功地建立了一株穩(wěn)定分泌抗GPC3單克隆抗體的雜交瘤細胞株，應(yīng)用獲得的抗GPC3單抗進行間接免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)該抗體與肝癌細胞中天然結(jié)構(gòu)的GPC3蛋白特異性結(jié)合，證明GPC3單克隆抗體不僅能夠識別基因工程表達的蛋白，還能特異性識別肝癌細胞表達的GPC3，為進一步應(yīng)用于肝癌的臨床診斷、預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)及個體化治療奠定了基礎(chǔ)。

Figure 2 The sequencing figure of GPC3 gene圖2 GPC3基因測序圖

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（2013-09-28收稿 2013-12-03修回）

（本文編輯 李國琪）

Preparation and Preliminary Application of Monoclonal Antibody Against Carcinoembryonic Antigen Glypican-3

WANG Yuliang,LIU Tao，MU Hong
Tianjin First Central Hospital,Key Laboratory for Critical Care Medicine of the Ministry of Health,Tianjin 300192,China

ObjectiveTo prepare monoclonal antibody specifically against carcinoembryonic antigen glypican-3(GPC3)and its preliminary application.MethodsGPC3 was cloned with PCR to pET16b vector and expressed in E.coliBL21.Spleen cells were obtained from Balb/c mice embedding immunized with purified antigen intraperitoneally,and fused with Sp2/0 cells.Hybridoma cells were screened by indirect ELISA,and identified by Western blot assay using purified protein after the cell fusion.The indirect immunofluorescence method was used to detect the GPC3 expression in HepG2 cell line.ResultsThe prokaryotic expression vector of GPC3 was successfully constructed,and GPC3 was stably expressed in E.coliBL21.A mouse hybridoma cell line secreting monoclonal antibody to GPC3 was obtained.Western blot analysis showed that monoclonal antibody specifically recognized recombinant protein.Monoclonal antibody could be used to detect GPC3 protein expression in HepG2 cell line by indirect immunofluorescence.ConclusionThe monoclonal antibody against GPC3 was successfully obtained.

glypicans;antibodies,monoclonal;recombinant fusion proteins;hybridomas;cell line;carcinoma,hepatocellular;GPC3;monoclonal antibody

R392.11【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.013

*天津市衛(wèi)生局重點學(xué)科建設(shè)-重點實驗室建設(shè)經(jīng)費資助項目；國家臨床重點?？平ㄔO(shè)項目資助課題

天津市第一中心醫(yī)院，衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點實驗室（郵編300192）

△通訊作者 E-mail：tjmuhong@sina.com