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    長(zhǎng)白山區(qū)野生香薷中揮發(fā)油的提取及其抑菌性研究

    2014-08-07 09:40:49江章濤李富強(qiáng)方凌玉
    吉林農(nóng)業(yè)·下半月 2014年6期
    關(guān)鍵詞:揮發(fā)油

    江章濤++李富強(qiáng)++陳++晨+方凌玉+張永健+吳園園+于加平

    摘要:采用水蒸氣蒸餾法對(duì)長(zhǎng)白山野生香薷中揮發(fā)油進(jìn)行提取,再用藥敏紙片法和二倍稀釋法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn),研究其抑菌活性。 結(jié)果表明長(zhǎng)白山野生香薷揮發(fā)油對(duì)細(xì)菌和真菌均有一定的抑菌效果。結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)長(zhǎng)白山野生香薷的藥用價(jià)值提供了良好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:野生香薷;水蒸氣蒸餾法;揮發(fā)油;抑菌性

    基金項(xiàng)目:吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(吉農(nóng)院合字[2013]第067號(hào));吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(吉農(nóng)院合字[2013]第X005號(hào))

    中圖分類號(hào):Q949 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào): 1674-0432(2014)-12-20-2

    香薷(mosla herb)屬唇形科二年生草本植物,散發(fā)香氣,又叫香菜,是東北農(nóng)村傳統(tǒng)的食物調(diào)料,其香味極濃,可增強(qiáng)口感;香薷主要分布于江西、陜西、山東、甘肅和吉林等地,在我國資源豐富,其中以江西產(chǎn)量大,品質(zhì)佳,又稱“江香薷”。目前主要是對(duì)“江香薷”中的黃酮、多糖和揮發(fā)油進(jìn)行研究,而對(duì)長(zhǎng)白山區(qū)的野生香薷的揮發(fā)油的相關(guān)研究卻鮮見報(bào)道。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道揮發(fā)油具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、解熱、緩解腸痙攣等功效 [1,2]。為了更好地研究、了解、利用長(zhǎng)白山野生香薷,本論文將以長(zhǎng)白山野生香薷為原料,采用水蒸汽蒸餾技術(shù)對(duì)其中的揮發(fā)油進(jìn)行提取,并利用藥敏紙片法和二倍稀釋法對(duì)其揮發(fā)油的抑菌性進(jìn)行研究,為長(zhǎng)白山區(qū)野生香薷的藥用價(jià)值的開發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1原料與試劑 長(zhǎng)白山野生香薷,采自吉林省長(zhǎng)白山區(qū)內(nèi),經(jīng)專家鑒定為長(zhǎng)白山野生香薷,處理為干品,通過粉碎機(jī)制成干燥的香薷粉末。NaCl、無水 Na2SO4、乙醚為分析純。

    1.1.2菌種 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、霉菌、青霉、黑曲霉、酵母以上菌種均由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.1.3培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。蛋白胨10.0克,牛肉浸膏5.0克,NaCl 5.0克,瓊脂20.0克, pH 7.2,121 ℃滅菌20分鐘。

    1.1.4儀器與設(shè)備 揮發(fā)油提取器、FWl00型高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)、LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)、ZD-85氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱(常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠)、AIR-TECH型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1水蒸氣蒸餾法提取香薷揮發(fā)油 參考水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油的相關(guān)文獻(xiàn)[3,4],準(zhǔn)確稱取100.00克干燥野生香薷粉末,置于揮發(fā)油提取器內(nèi),連接水蒸氣蒸餾裝置后開始提取,收集餾出液,向餾出液中加入NaCl,靜置后用乙醚萃?。?0毫升×3次),合并萃取液,向萃取液中加入適量無水Na2SO4后,低溫干燥24小時(shí)后再進(jìn)行過濾,旋蒸回收乙醚,收集揮發(fā)油并計(jì)算揮發(fā)油得率,置于冰箱內(nèi)備用。

    1.2.2菌懸液的制備 將供試的細(xì)菌和真菌的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上活化,用無菌接種環(huán)從斜面上挑取各供試菌種,將其接種到液體培養(yǎng)基中,細(xì)菌菌種在溫度37℃、轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)24小時(shí),真菌菌種在溫度28℃、轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)48小時(shí),用無菌蒸餾水將供試菌進(jìn)行稀釋。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法,具體計(jì)算公式如下:1mL菌液中的總菌數(shù)/個(gè)=平均每個(gè)小格的總菌數(shù)×25×16×1000×稀釋倍數(shù),分別調(diào)整至終濃度為106CFU/mL的菌懸液和104CFU/mL的孢子懸液,備用。

    1.2.3藥敏紙片法測(cè)定抑菌圈 用無水乙醇將香薷揮發(fā)油母液分別稀釋成25毫克/毫升、15毫克/毫升和5毫克/毫升,置于3支不同的試管內(nèi),備用。

    打孔器將干凈的濾紙制成直徑為6毫米的小圓紙片,高溫蒸汽滅菌后,置于25毫克/毫升、15毫克/毫升和5毫克/毫升這3種不同質(zhì)量濃度的揮發(fā)油中浸泡2小時(shí),再用無菌鑷子移至無菌平皿中,分別加入2~3滴這3種不同濃度的香薷揮發(fā)油,放在干燥箱內(nèi)烘干,制成飽和的藥敏紙片。在超凈工作臺(tái)上,將滅菌后的固體培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中,每皿15毫升。待冷卻凝固后,用移液器吸取0.1毫升菌液至培養(yǎng)基平板上,用涂布器將菌液涂布均勻,然后正置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)(細(xì)菌培養(yǎng)溫度37℃,真菌培養(yǎng)溫度28℃)。1小時(shí)后,將飽和的藥敏紙片呈品字狀貼于平皿上,并設(shè)無水乙醇濾紙片作為空白對(duì)照,然后放在恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)。細(xì)菌置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后觀察,測(cè)量并記錄抑菌圈的直徑;真菌置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)后觀察,測(cè)量并記錄抑菌圈的直徑。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次,取平均值。

    以抑菌圈直徑的大小為參考指標(biāo),根據(jù)抗菌物質(zhì)抑菌圈試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)[5],得出如下的結(jié)論:抑菌圈直徑大于15毫米為高度敏感,抑菌性強(qiáng);抑菌圈直徑在10~15毫米之間為中度敏感,抑菌性中等;抑菌圈直徑在7~9毫米之間為低度敏感,抑菌性弱;抑菌圈直徑小于7毫米為不敏感,無抑菌性。

    1.2.4二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)在無菌條件下,將14支滅菌試管,平均分成兩組,每組7支,一組用于測(cè)定細(xì)菌的MIC和MBC,另一組用于測(cè)定真菌的MIC和MBC。采用二倍稀釋法[6],用無水乙醇將香薷揮發(fā)油母液分別稀釋成25.0000、12.5000、6.2500、3.1250、1.5625、0.78125毫克/毫升,將這6種不同濃度的揮發(fā)油分別加入到第1~6支試管中,往第7支試管中加入等量的無水乙醇。用移液器分別移取1毫升不同濃度的揮發(fā)油至無菌培養(yǎng)皿中,加入14毫升冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,真菌用馬鈴薯固體培養(yǎng)基),將藥液和培養(yǎng)基混勻,冷凝待用。將1毫升無水乙醇與14毫升冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)基混合的稀釋劑設(shè)為對(duì)照組。

    待培養(yǎng)基冷卻凝固后,吸取制備好的菌懸液或孢子懸液0.1毫升,將其均勻涂布于上述平皿表面,先放在恒溫箱中正置培養(yǎng)1小時(shí)(細(xì)菌37℃,真菌28℃)后,取出平皿,用封口膜包裝后,再放在恒溫箱中倒置培養(yǎng)(細(xì)菌37℃,24小時(shí);真菌28℃,24小時(shí)),然后觀察并記錄供試菌的生長(zhǎng)情況,與對(duì)照組進(jìn)行比較,生長(zhǎng)菌體的,記為陽性(+),不生長(zhǎng)菌體的,記為陰性(-);以不生長(zhǎng)菌體的最小的揮發(fā)油濃度,記為香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度(MIC),將上述測(cè)出MIC的各菌液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后,此時(shí)不生長(zhǎng)菌體的最小的揮發(fā)油濃度,記為香薷揮發(fā)油的最小殺菌濃度(MBC)。

    2 結(jié)果與分析

    按1.2.1方法得長(zhǎng)白山野生香薷的含量為1.74%。

    2.1 野生香薷揮發(fā)油抑菌活性的測(cè)定結(jié)果

    按1.2.2,1.2.3方法測(cè)定野生香薷揮發(fā)油抑菌活性,結(jié)果見表1,表2。

    表1 野生香薷揮發(fā)油對(duì)細(xì)菌的抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果(mm)

    表2野生香薷揮發(fā)油對(duì)真菌的抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果(mm)

    由表1和表2可以看出,野生香薷揮發(fā)油母液對(duì)6種供試菌的抑菌效果明顯不同,而且對(duì)細(xì)菌的抑菌強(qiáng)度和對(duì)真菌的抑菌強(qiáng)度是不同的。野生香薷揮發(fā)油對(duì)細(xì)菌的抑菌圈直徑隨濃度的增加而變大,而且對(duì)枯草桿菌的抑制效果最好,對(duì)大腸桿菌的抑制效果最差;香薷揮發(fā)油對(duì)真菌的抑菌圈直徑也隨濃度的增加而變大,并且對(duì)黑曲霉的抑制效果最好,對(duì)酵母的抑制效果最差。從表4可以得知,當(dāng)香薷揮發(fā)油的濃度為5毫克/毫升時(shí),對(duì)酵母幾乎沒有抑制作用,不出現(xiàn)抑菌圈。從總體上看,野生香薷揮發(fā)油母液對(duì)6種供試菌的抑菌圈直徑大小關(guān)系為:枯草桿菌>金黃色葡萄球菌>黑曲霉>青霉>大腸桿菌>酵母,香薷揮發(fā)油對(duì)枯草桿菌、金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用,而對(duì)酵母有較弱的抑制作用。

    2.2 野生香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定結(jié)果

    按1.2.4,1.2.5方法測(cè)長(zhǎng)白山野生香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC),結(jié)果見表3和表4。

    由表3和表4可知:野生香薷揮發(fā)油對(duì)酵母的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)最大,對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)最小,香薷揮發(fā)油對(duì)6種供試菌的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)是不同的,其測(cè)定的結(jié)果與抑菌圈直徑大小的測(cè)定結(jié)果是相符的。

    野生香薷揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母、青霉、黑曲霉的最小抑菌濃度分別為6.2500、3.1250、3.1250、12.5000、6.2500、6.2500毫克/毫升;最小殺菌濃度分別為12.5000、6.2500、6.2500、25.0000、12.5000、12.5000毫克/毫升??偟膩碚f,香薷揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的抑菌作用較強(qiáng),對(duì)酵母的抑菌作用最弱。

    表3 野生香薷揮發(fā)油的MIC(mg/mL)

    表4 野生香薷揮發(fā)油的MBC(mg/mL)

    3 結(jié)語

    為了合理應(yīng)用長(zhǎng)白山區(qū)野生香薷這一寶貴資源,通過水蒸氣蒸餾技術(shù)提取香薷中的揮發(fā)油,并對(duì)其抑菌性進(jìn)行了研究。采用藥敏紙片法和二倍稀釋法,研究揮發(fā)油稀釋液的抑菌效果,觀察到香薷揮發(fā)油有明顯抑制菌斑生長(zhǎng)的作用,能有效抑制菌斑中細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)繁殖。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,香薷揮發(fā)油對(duì)試驗(yàn)所選的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母、青霉和黑曲霉這6種菌種均有明顯的抑菌效果,對(duì)酵母幾乎沒有抑菌作用。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果為香薷揮發(fā)油在醫(yī)藥、食品等方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。香薷揮發(fā)油的一些藥理作用與其化學(xué)成分有密切的關(guān)系,但作用機(jī)理目前尚不明確,還有待于進(jìn)一步探討。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 金偉.長(zhǎng)白山野生香薷及其人工栽培技術(shù)[J].蔬菜,1997,(3):16.

    [2] 衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:196,附錄57.

    [3] 陳根順,李鵬,陳陽.江香薷揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,(05):61-63.

    [4] 羅琴,李星,李洋.益智仁揮發(fā)油的水蒸氣蒸餾法提取工藝優(yōu)化及其體外抑菌活性的研究[J].華西藥學(xué)雜志,2011,26(2):147-149.

    [5] 趙玉清,劉寶全,李慧,蔣本國.殼聚糖-Ag(Ⅰ)的配位與抑菌性研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,(05):20-22.

    [6] 葛暢,胡月英,陳文學(xué).香辛料抑菌性及抗氧化性研究現(xiàn)狀[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程,2008,(01):14-17.

    作者簡(jiǎn)介:江章濤,本科學(xué)歷,吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院。

    通訊作者:于加平,吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院,副教授,研究方向:分析化學(xué)和天然產(chǎn)物方面的教學(xué)與研究。

    2.2 野生香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定結(jié)果

    按1.2.4,1.2.5方法測(cè)長(zhǎng)白山野生香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC),結(jié)果見表3和表4。

    由表3和表4可知:野生香薷揮發(fā)油對(duì)酵母的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)最大,對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)最小,香薷揮發(fā)油對(duì)6種供試菌的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)是不同的,其測(cè)定的結(jié)果與抑菌圈直徑大小的測(cè)定結(jié)果是相符的。

    野生香薷揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母、青霉、黑曲霉的最小抑菌濃度分別為6.2500、3.1250、3.1250、12.5000、6.2500、6.2500毫克/毫升;最小殺菌濃度分別為12.5000、6.2500、6.2500、25.0000、12.5000、12.5000毫克/毫升??偟膩碚f,香薷揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的抑菌作用較強(qiáng),對(duì)酵母的抑菌作用最弱。

    表3 野生香薷揮發(fā)油的MIC(mg/mL)

    表4 野生香薷揮發(fā)油的MBC(mg/mL)

    3 結(jié)語

    為了合理應(yīng)用長(zhǎng)白山區(qū)野生香薷這一寶貴資源,通過水蒸氣蒸餾技術(shù)提取香薷中的揮發(fā)油,并對(duì)其抑菌性進(jìn)行了研究。采用藥敏紙片法和二倍稀釋法,研究揮發(fā)油稀釋液的抑菌效果,觀察到香薷揮發(fā)油有明顯抑制菌斑生長(zhǎng)的作用,能有效抑制菌斑中細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)繁殖。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,香薷揮發(fā)油對(duì)試驗(yàn)所選的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母、青霉和黑曲霉這6種菌種均有明顯的抑菌效果,對(duì)酵母幾乎沒有抑菌作用。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果為香薷揮發(fā)油在醫(yī)藥、食品等方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。香薷揮發(fā)油的一些藥理作用與其化學(xué)成分有密切的關(guān)系,但作用機(jī)理目前尚不明確,還有待于進(jìn)一步探討。

    參考文獻(xiàn)

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    [5] 趙玉清,劉寶全,李慧,蔣本國.殼聚糖-Ag(Ⅰ)的配位與抑菌性研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,(05):20-22.

    [6] 葛暢,胡月英,陳文學(xué).香辛料抑菌性及抗氧化性研究現(xiàn)狀[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程,2008,(01):14-17.

    作者簡(jiǎn)介:江章濤,本科學(xué)歷,吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院。

    通訊作者:于加平,吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院,副教授,研究方向:分析化學(xué)和天然產(chǎn)物方面的教學(xué)與研究。

    2.2 野生香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定結(jié)果

    按1.2.4,1.2.5方法測(cè)長(zhǎng)白山野生香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC),結(jié)果見表3和表4。

    由表3和表4可知:野生香薷揮發(fā)油對(duì)酵母的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)最大,對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)最小,香薷揮發(fā)油對(duì)6種供試菌的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)是不同的,其測(cè)定的結(jié)果與抑菌圈直徑大小的測(cè)定結(jié)果是相符的。

    野生香薷揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母、青霉、黑曲霉的最小抑菌濃度分別為6.2500、3.1250、3.1250、12.5000、6.2500、6.2500毫克/毫升;最小殺菌濃度分別為12.5000、6.2500、6.2500、25.0000、12.5000、12.5000毫克/毫升??偟膩碚f,香薷揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的抑菌作用較強(qiáng),對(duì)酵母的抑菌作用最弱。

    表3 野生香薷揮發(fā)油的MIC(mg/mL)

    表4 野生香薷揮發(fā)油的MBC(mg/mL)

    3 結(jié)語

    為了合理應(yīng)用長(zhǎng)白山區(qū)野生香薷這一寶貴資源,通過水蒸氣蒸餾技術(shù)提取香薷中的揮發(fā)油,并對(duì)其抑菌性進(jìn)行了研究。采用藥敏紙片法和二倍稀釋法,研究揮發(fā)油稀釋液的抑菌效果,觀察到香薷揮發(fā)油有明顯抑制菌斑生長(zhǎng)的作用,能有效抑制菌斑中細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)繁殖。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,香薷揮發(fā)油對(duì)試驗(yàn)所選的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母、青霉和黑曲霉這6種菌種均有明顯的抑菌效果,對(duì)酵母幾乎沒有抑菌作用。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果為香薷揮發(fā)油在醫(yī)藥、食品等方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。香薷揮發(fā)油的一些藥理作用與其化學(xué)成分有密切的關(guān)系,但作用機(jī)理目前尚不明確,還有待于進(jìn)一步探討。

    參考文獻(xiàn)

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    作者簡(jiǎn)介:江章濤,本科學(xué)歷,吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院。

    通訊作者:于加平,吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院,副教授,研究方向:分析化學(xué)和天然產(chǎn)物方面的教學(xué)與研究。

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