氨三乙酸聯合微生物對高羊茅修復重金屬污染土壤的強化作用

常 晨，多立安，趙樹蘭

（天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

天津污灌區(qū)土壤中重金屬嚴重超標[1]，土壤修復工作迫在眉睫.目前，在重金屬污染土壤修復中，植物因具有良好的社會、經濟和環(huán)境綜合效益，適用于大規(guī)模污染土壤的修復.利用植物修復土壤的研究也有一些報道[2-3]，如高羊茅對重金屬污染土壤就有一定的修復作用[4].有研究認為添加螯合劑能促進植物提取更多的重金屬[5-6].微生物修復技術在治理重金屬污染方面也有很多優(yōu)勢，如成本低、環(huán)境友好、無二次污染等[7-9].城市污泥的化學組成一般都含有一定量的Cu、Pb、Zn、Ni、Cr、Cd、Hg 等重金屬[10].從城市污泥中提取的微生物，很可能對重金屬具有抗性，可以嘗試用于重金屬修復.本課題組將螯合劑氨三乙酸（NTA）、城市污泥中提取的微生物和高羊茅三者聯合起來，研究螯合劑和微生物對高羊茅修復重金屬污染土壤的強化作用.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選用草坪植物高羊茅（Festuca arundinacea L.）為實驗材料.

污泥取自天津市紀莊子污水處理廠，采用稀釋分離法分別制備細胞濃度 10-3、10-4、10-5、10-6/L 的污泥懸浮液，根據所分離的微生物，取相應濃度的污泥懸浮液，搖勻后吸取0.2 mL加入到預先制好的平板中（真菌用馬丁氏瓊脂平板，放線菌用高氏一號瓊脂平板，細菌用牛肉膏蛋白胨平板），用滅菌的涂布器涂抹均勻，每個處理重復3次，28℃培養(yǎng).根據平板內菌落的形態(tài)、大小、色澤和生長速度等，從每個樣品中盡可能多地挑取單菌落劃線純化.依據菌落性狀和形態(tài)特征對菌株歸類和統(tǒng)計數量，確定相應的優(yōu)勢菌，對其編號并保存.對優(yōu)勢菌進行基因擴增后，送至上海美吉基因公司測序.在NCBI網站上，采用BLAST軟件將測序結果與GenBank核酸數據庫中相關種屬的16S rDNA和18S rDNA序列進行同源性比較.最終確定本研究所用菌種為施氏假單胞菌、里氏木霉和灰黃鏈霉菌，將這3種微生物按體積比1∶1∶1的比例混合，配制成復合微生物菌液.

選用氨三乙酸（NTA）作為螯合劑，分析純，由國藥集團化學試劑有限公司生產.

供試土壤取自天津市西青區(qū)污灌區(qū).將采集的土壤去除草根、石塊后，放置于通風處，自然風干2～3 d后，過2 mm篩備用.土壤理化性質測定參考文獻[11].土壤有機質質量分數為3.62%，全氮質量分數為0.19%，全磷量為5.4 g/kg，全鉀量為787.3 mg/kg，pH為7.28，土壤含水量為4.13%，電導率為0.44 mS/cm.每千克土壤中 Cd、Cu和 Zn的含量分別為 7.13、146.31和795.56 mg，分別是土壤環(huán)境質量二級標準（GB156182-1995）的 23.8、1.5和 3.2倍.

1.2 土壤處理

供試土壤共設置8個處理，分別標記為：（Ⅰ）不加NTA和菌液的對照土壤；（Ⅱ）每千克土壤添加5 mmol NTA；（Ⅲ）每千克土壤添加10 mmol NTA；（Ⅳ）每千克土壤添加15 mmol NTA；（Ⅴ）土壤中只加菌液；（Ⅵ）每千克土壤中添加菌液和5 mmol NTA；（Ⅶ）每千克土壤中添加菌液和10 mmol NTA；（Ⅷ）每千克土壤中添加菌液和15 mmol NTA.每個處理重復3次.

1.3 草坪植物培養(yǎng)

以直徑為7 cm、高度為8 cm的塑料杯為培養(yǎng)容器，每杯加入170 g未添加NTA和菌液的土壤，播種0.5 g高羊茅種子.植物生長15 d后，向處理V、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ中加入15 mL菌液.植物生長25 d后向各組添加不同濃度的NTA，NTA處理10 d后收獲高羊茅.實驗周期為35 d.高羊茅培養(yǎng)在實驗室內進行，經常調換位置以保證光照一致，培養(yǎng)期間室溫17～31℃，相對濕度38%～60%.培植期間正常供水.

1.4 指標測定

生物量的測定：播種35 d后收獲高羊茅，分為地上和地下部，經去離子水反復沖洗后，將其放入烘箱中，80℃下烘干至恒重，測其干重.

重金屬含量的測定：稱取植物樣品0.1 g，用硝酸、高氯酸、硫酸混和液（體積比8∶1∶1）消解后，所得溶液用蒸餾水定容至25 mL，用TAS-990原子吸收分光光度計測定消化液中重金屬（Cd、Cu、Zn）的含量.

1.5 數據分析處理

采用SPSS17.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析.

2 結果與分析

2.1 NTA和微生物對高羊茅生物量的影響

不同處理對高羊茅生物量的影響如表1所示.

由表1可以看出，5 mmol/kg NTA處理增加了高羊茅地上部生物量，比對照組增加4.7%；而10 mmol/kg和15 mmol/kg NTA處理則抑制了高羊茅地上部生物量的積累.添加菌液后，高羊茅地上部生物量顯著增加，尤其以單獨添加菌液的處理效果最明顯，和對照組相比，增加了27.6%，添加菌液的4個處理間的差異不具有統(tǒng)計學意義（p＞0.05）.除15 mmol/kg NTA處理外，各處理組的高羊茅地下生物量均高于對照組，其中單獨添加菌液的處理對高羊茅根部生物量的積累促進作用最明顯，比對照組提高了約50%.總之，單獨添加菌液對高羊茅生物量積累的促進效果最好，聯合使用NTA后，高羊茅生物量的積累略有下降，但也顯著高于對照組，尤其是地上部生物量的積累.

表1 不同處理對高羊茅生物量的影響Tab.1 Effects of different treatments on the biomass of F.arundinacea

2.2 NTA和微生物對高羊茅地上部重金屬含量的影響

土壤中添加NTA和菌液后，高羊茅地上部重金屬含量的變化如表2所示.

表2 不同處理下高羊茅地上部的重金屬含量Tab.2 Heavy metal concentrations in shoots of F.arundinacea under different treatments μg/g

由表2可以看出，單獨添加NTA處理的高羊茅地上部Cd含量隨NTA濃度的增加呈上升趨勢，高濃度處理組與對照組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義（p≤0.05）.NTA+菌液的處理方式進一步增加了高羊茅地上部分對Cd的富集，其中10 mmol/kg NTA+菌液處理組中高羊茅地上部Cd含量達到最大，是同等濃度NTA單獨處理的1.35倍.

單獨添加NTA處理的高羊茅地上部Cu含量也是隨著NTA濃度的增加而增加，但只有NTA濃度達到10 mmol/kg后，地上部Cu的含量才顯著高于對照組.NTA+菌液的處理方式也增加了高羊茅地上部對Cu的積累，但同單獨添加NTA相比，作用效果并沒有顯著提升.所有處理中，單獨添加15 mmol/kg NTA處理中高羊茅地上部Cu的積累最多.

高羊茅地上部分對Zn的積累中，隨著NTA濃度的增加，地上部Zn的含量也呈增加趨勢，15 mmol/kg NTA處理組中高羊茅地上部分Zn的含量是對照組的11倍.NTA+菌液的處理組中，5 mmol/kg NTA+菌液組中高羊茅地上部分Zn的含量最多，是對照組的15.15倍.高濃度的NTA聯合添加菌液未能顯著提升高羊茅對Zn的積累.

總的來看，單獨添加菌液處理中，高羊茅地上部Cd、Cu、Zn的含量與對照組之間的差異沒有統(tǒng)計學意義（p＞0.05），表明混合菌液對高羊茅轉運吸收重金屬沒有顯著影響.單獨添加NTA可以提高高羊茅地上部分對重金屬Cd、Cu、Zn的積累，并且隨著NTA濃度的增加，高羊茅地上部分重金屬的含量也增加.螯合劑與菌液聯合使用后，在一定程度上提高了高羊茅地上部分對重金屬的富集能力，但對于不同的金屬，螯合劑與菌液的最佳配比也不同.

2.3 NTA和微生物對高羊茅根部重金屬含量的影響

土壤中添加NTA和菌液后，高羊茅根部重金屬含量的變化如表3所示.

表3 不同處理下高羊茅根部的重金屬含量Tab.3 Heavy metal concentrations in roots of F.arundinacea under different treatments μg/g

由表3可知，單獨添加NTA的處理中，隨著NTA濃度的增加，高羊茅根部Cd的含量也增加，但幅度不大.土壤中聯合添加菌液后，高羊茅根部對Cd的積累增加較多，高于同等濃度NTA單獨處理的效果，其中15 mmol/kg NTA+菌液處理下高羊茅根部Cd含量最大，是對照組的2.72倍.

對土壤Cu的去除效果中，單獨添加NTA時，隨著NTA濃度的增加，高羊茅根部Cu的含量顯著增加，高濃度NTA處理組同對照組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義（p≤0.05）.聯合添加菌液時，高濃度NTA處理組高羊茅根部對Cu的積累也顯著高于對照組，但15 mmol/kg NTA+菌液處理組中，高羊茅根部Cu的含量低于單獨添加同等濃度NTA的處理.

單獨添加NTA的處理組中，高羊茅根部Zn的含量也是隨著NTA濃度的增加而增加，高濃度NTA處理組同對照組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（p≤0.05）.聯合添加菌液后，5 mmol/kg和10 mmol/kg NTA處理組高羊茅根部對Zn的富集增加，15 mmol/kg NTA處理組添加菌液后，高羊茅根部對Zn的富集作用反而下降.

總的來看，單獨添加菌液中，高羊茅根部對重金屬的富集作用沒有顯著提升，甚至對金屬Cu和Zn的富集作用下降；單獨添加NTA時，隨著NTA濃度的增加，高羊茅根部對重金屬的富集作用增強；螯合劑聯合添加菌液后，高羊茅根部對重金屬的富集效果進一步提高，尤其是對Cd的富集作用較單獨添加NTA處理更為顯著.

3 討論與結論

在植物對重金屬污染土壤的修復過程中，添加微生物可能會提高植物的生物量.如馬文亭等[12]發(fā)現，在不同的Cd污染水平下，土壤中添加里氏木霉能夠增加伴礦景天的生物量，提高其對Cd的抗性和對Cd污染土壤的修復效率；Usman等[13]研究AM菌根和EDTA對玉米和向日葵吸收Pb、Zn、Cd和Cu的影響，結果發(fā)現，接種AM后2種植物的地上部分和根部的生物量都增加.本研究發(fā)現，向污灌區(qū)土壤中添加污水處理廠中分離出的菌液，高羊茅地上部和根部的生物量都顯著高于對照組和單獨添加NTA的處理，即菌液對高羊茅的生長有促進作用.Quartacci等[14]的研究表明，單獨添加NTA沒有影響埃塞俄比亞芥的根長和地上部/根部的質量比.本研究中單獨添加NTA也未能顯著影響高羊茅的地上和根部生物量，而菌液與NTA聯合使用，則能顯著提高高羊茅的地上生物量.

在植物對土壤重金屬的富集作用中，有研究表明，螯合劑能活化土壤重金屬，促進植物對重金屬的吸收和富集[15].本研究發(fā)現，單獨添加NTA能提高高羊茅全株的重金屬含量，并且高羊茅對重金屬的積累隨著土壤中NTA含量的增加而增加.而單獨添加菌液對高羊茅富集重金屬的能力沒有顯著影響，這與翁高藝等[16]的研究一致.研究螯合劑與菌液聯合作用下高羊茅對重金屬的富集作用，結果發(fā)現，針對高羊茅的不同部位和土壤中不同的重金屬，螯合劑與菌液的最佳配比也不同.對于金屬Cd，高羊茅地上部分的最佳處理是10 mmol/kg NTA+菌液，根部達到最大含量的處理方式是15 mmol/kg NTA+菌液；對于金屬Cu，全株植物都是單獨添加15 mmol/kg NTA的效果最好；對于金屬Zn，地上部分的最佳處理是5 mmol/kg NTA+菌液，根部則是單獨添加15 mmol/kg NTA的效果最好.由此可見，螯合劑與菌液共同添加對根部重金屬含量的提高有一定的局限性，可能是由于二者的聯合作用促進高羊茅地上部生長的同時，根部向地上部轉移了更多的重金屬.綜合修復效果和經濟成本，可考慮用10 mmol/kg NTA與微生物菌液聯合使用，強化高羊茅對污灌區(qū)土壤重金屬污染的修復效果.

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