雙酚A暴露對成年小鼠焦慮行為的影響*

徐曉虹， 王 喻， 董芳妮

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

雙酚A(bisphenol-A,BPA)是一種廣泛應(yīng)用于環(huán)氧樹脂、聚碳酸酯、酚醛樹脂等工業(yè)生產(chǎn)和飲料容器、食品包裝等日常生活塑料制品的典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有弱雌激素和抗雄激素活性.由于性激素在神經(jīng)發(fā)育及其性別分化中的重要作用，近年來關(guān)于BPA對腦和行為發(fā)育的影響受到人們的關(guān)注，發(fā)現(xiàn)發(fā)育期BPA暴露可影響動物成年后的焦慮和抑郁、學(xué)習(xí)記憶等多種神經(jīng)行為[1-3].前期研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期、哺乳期、青春期BPA暴露均可影響仔鼠成年后的焦慮和抑郁樣行為，但不同發(fā)育階段BPA暴露對焦慮和抑郁行為的影響有性別差異[4-5].另外，性激素也參與調(diào)節(jié)成年動物的腦功能活動，且成年動物暴露于BPA環(huán)境的時間更長.因此，BPA對成年動物腦和行為的影響已引起人們的重視.Kim等[6]發(fā)現(xiàn)青年雄性小鼠BPA暴露2周后空間記憶受損；文獻(xiàn)[7]報道BPA在損傷雄性成年大鼠物體識別和空間位置視覺記憶的同時降低海馬樹突棘密度.文獻(xiàn)[8]研究發(fā)現(xiàn)，BPA慢性暴露選擇性損傷成年雄鼠的記憶行為,同時降低海馬突觸密度.焦慮行為是對腦內(nèi)性激素改變極為敏感的情感行為[9].有研究表明，女性患焦慮癥的幾率是男性的2倍，尤其女性到了絕經(jīng)期之后，由于雌激素水平下降焦慮情緒會加重，而雌激素補(bǔ)充可以減緩老年雌性小鼠的焦慮樣狀態(tài)[10].因此，推測長期暴露于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物BPA可能影響成年小鼠的焦慮行為.本文對此進(jìn)行了研究.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

清潔級ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量25～35 g，由浙江省金華市藥品檢驗(yàn)所提供.實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，自由進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境晝夜12 h交替,室溫22～25 ℃，濕度50%～60%.小鼠雌雄分籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分為BPA暴露組(0.04,0.4,4和40 mg/(kg·d))和對照組(V(菜籽油)∶V(乙醇)=9∶1).BPA(含量≥99.5%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)用菜籽油-乙醇(V(菜籽油)∶V(乙醇)=9∶1)溶解，每天灌胃染毒持續(xù)12周,灌胃體積為0.1 mL(以體質(zhì)量30 g計).每天觀察動物的飲食和活動情況，注意小鼠的皮膚、被毛、眼睛、呼吸及行為等的變化.每周稱體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥體積.染毒結(jié)束3 d后進(jìn)行檢測實(shí)驗(yàn).

1.2 性激素含量測定

小鼠染毒結(jié)束3 d后，每組隨機(jī)取8只小鼠眼眶采血1 mL左右，4 ℃靜止30 min,之后3 000 r/min離心5 min，收集血清.小鼠斷頭取腦，分離大腦，稱質(zhì)量，按1∶10的比例加入生理鹽水，剪碎，勻漿，4 ℃ 5 000 r/min離心6 min，取上清.使用放射免疫分析法檢測雌、雄小鼠血清和腦內(nèi)雌二醇和睪酮的含量.

1.3 行為測試

在BPA暴露結(jié)束后3 d，每組隨機(jī)取12只小鼠，在安靜的行為檢測室依次進(jìn)行行為檢測.

1.3.1 曠場行為檢測

1.3.2 明暗箱行為檢測

實(shí)驗(yàn)裝置由一黑色封閉箱(25 cm×25 cm×35 cm)和一白色敞開箱(25 cm×25 cm×35 cm)組成，兩箱之間有一穿梭孔(5 cm×7 cm).將小鼠放入明箱中央，記錄小鼠5 min內(nèi)在兩箱間的穿梭次數(shù)，以及在明、暗箱內(nèi)的停留時間.穿梭次數(shù)反映小鼠的活動性；兩箱停留時間可反映其焦慮狀態(tài)[12].每只小鼠檢測后清理箱內(nèi)殘留物及氣味，以免影響下一只小鼠的行為.

1.3.3 鏡子迷宮行為檢測

鏡子迷宮是由一四面裝有鏡子的鏡箱區(qū)(30 cm×25 cm×30 cm)和一不安裝鏡子的非鏡箱區(qū)(30 cm×5 cm×30 cm)組成的正方形敞箱(30 cm×30 cm×30 cm)，鏡箱與非鏡箱之間有一直徑為5 cm的通道供小鼠穿行.測試時將小鼠放入鏡箱區(qū)中央，記錄小鼠5 min內(nèi)在鏡箱區(qū)與非鏡箱區(qū)之間的穿梭次數(shù)，以及在鏡箱區(qū)的停留時間.鏡箱區(qū)與非鏡箱區(qū)穿梭次數(shù)可反映小鼠的活動性;而鏡箱區(qū)停留時間作為小鼠焦慮程度的行為參數(shù)[13].每次測試結(jié)束后清理箱體.

1.3.4 高架十字迷宮行為檢測

高架十字迷宮由2個相對的開放臂(30 cm×5 cm)、2個相對的封閉臂(30 cm×5 cm×15 cm)和1個連接4臂的中央平臺(5 cm×5 cm)組成，距地面50 cm.測試時小鼠頭朝開放臂放入中央平臺區(qū)，記錄小鼠在迷宮中5 min的行為表現(xiàn).為防止小鼠在迷宮中留下氣味干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每只小鼠測試后用75%乙醇將迷宮擦洗l遍.各項(xiàng)指標(biāo)由小動物行為分析系統(tǒng)(TSE System GmbH,德國)記錄.開放臂進(jìn)入次數(shù)減少、停留時間縮短，或封閉臂停留時間延長,表明動物焦慮狀態(tài)增加；中央?yún)^(qū)探頭次數(shù)增多表明動物焦慮狀態(tài)弱，而探究欲望增強(qiáng)；封閉臂進(jìn)入次數(shù)或開放臂和封閉臂的總進(jìn)入次數(shù)增加,表明動物活動性增加[14].

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 體質(zhì)量、生殖器官質(zhì)量/體質(zhì)量

10周齡的小鼠體質(zhì)量各處理組和性別之間均無統(tǒng)計學(xué)差異.BPA暴露12周后，體質(zhì)量出現(xiàn)顯著的性別差異(F(1,118)=3.509，P=0.01)，雄鼠體質(zhì)量顯著高于雌鼠(P<0.01).BPA暴露對小鼠體質(zhì)量的影響見圖1.BPA暴露對雌、雄鼠生殖器官質(zhì)量/體質(zhì)量沒有顯著的影響(見圖2).

##表示與同處理雄性比較P<0.01圖1 BPA暴露對成年小鼠體質(zhì)量的影響(n=12)

圖2 BPA暴露12周對成年小鼠臟器系數(shù)的影響(n=12 )

2.2 血清和腦內(nèi)性激素含量

成年期BPA暴露明顯降低雄鼠腦和血清內(nèi)的睪酮水平，特別是0.4 mg/(kg·d)BPA組血清中睪酮含量顯著低于對照組(P<0.05)，0.04～4 mg/(kg·d)BPA組腦內(nèi)睪酮含量顯著低于對照組(P<0.05)；但對雌鼠腦和血清中雌二醇含量均沒有影響.說明長期BPA暴露可降低雄鼠腦和血清中的睪酮水平(見圖3).

2.3 行為學(xué)檢測

2.3.1 曠場行為

雙因素方差分析顯示，BPA暴露×性別的交互作用不影響小鼠在曠場中的跑動格數(shù)、站立次數(shù)、理毛次數(shù)和中央?yún)^(qū)停留時間，BPA暴露因素顯著影響小鼠的跑動格數(shù)(F(4,115)=3.858,P=0.006)，而性別因素顯著影響小鼠的站立次數(shù)(F(1,118)=83.712,P<0.001)、理毛次數(shù)(F(1,118)=57.321,P<0.001)和中央?yún)^(qū)停留時間(F(1,118)=44.363,P<0.001).正常雄鼠表現(xiàn)出比雌鼠更多的站立次數(shù)(P<0.01)、理毛次數(shù)(P<0.05)和中央?yún)^(qū)停留時間(P<0.05),表明雄鼠比雌鼠具有更強(qiáng)的探究欲望和更低的焦慮狀態(tài)；然而，0.04和0.4 mg/(kg·d)BPA暴露消除了小鼠中央?yún)^(qū)停留時間的性別差異(見表1).

表明長期BPA暴露可以消除小鼠焦慮狀態(tài)的性別差異.

2.3.2 明暗箱行為

BPA暴露×性別的交互作用、BPA暴露因素及性別因素均顯著影響小鼠在明暗箱的穿梭次數(shù)(F(4,110)=3.454,P=0.011;F(4,115)=4.88,P=0.001;F(1,118)=5.699,P=0.019).

*表示與同性別對照組相比P<0.05圖3 BPA暴露12周對成年小鼠血清和腦內(nèi)性激素含量的影響(n=8)

性別BPA處理量/(mg5kg-15d-1)5 min跑動格數(shù)理毛次數(shù)懸空站立次數(shù)中央?yún)^(qū)停留時間比/%雄鼠對照組195.00±10.5719.16±2.3821.33±5.0411.03±1.290.04207.83±6.3917.91±1.3034.08±5.2010.81±1.150.4167.50±6.3215.37±1.0324.50±3.5810.90±1.134175.92±8.3015.42±1.0031.17±3.3012.41±1.2540188.58±16.1517.69±1.42 35.7±3.1313.71±0.17雌鼠對照組197.83±6.899.58±0.87##10.75±1.54#6.27±0.61#0.04207.25±9.3610.25±1.31##10.08±2.55#8.55±0.560.4190.25±9.739.50±1.58##9.50±1.64#7.80±0.794195.75±11.8411.30±1.64#8.67±2.52#6.68±1.59#40159.92±7.18#10.88±1.03##11.58±2.86#7.93±0.91#

注：與雄性相比，#表示P<0.05；##表示P<0.01.各處理組與同性別對照組相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異.

如圖4所示：BPA暴露主要影響雄鼠的穿梭次數(shù)，與同性別對照組相比，4 mg/(kg·d)BPA組雄鼠的穿梭次數(shù)顯著降低(P<0.05)；0.4和4 mg/(kg·d)BPA組穿梭次數(shù)的性別差異極小.表明BPA減弱了雄鼠的運(yùn)動活性.

小鼠在明箱的停留時間表現(xiàn)出顯著的性別差異(F(1,118)=61.056,P<0.001)，雄鼠在明箱的停留時間明顯高于雌鼠(P<0.05)，即雌鼠表現(xiàn)出更高的焦慮樣狀態(tài)，BPA暴露對其沒有明顯的作用(見圖4).

2.3.3 鏡子迷宮實(shí)驗(yàn)

BPA暴露×性別的交互作用對小鼠在鏡子迷宮鏡區(qū)停留時間和鏡區(qū)與非鏡區(qū)的穿梭次數(shù)均沒有顯著影響.BPA暴露不影響小鼠的鏡區(qū)停留時間，但顯著影響鏡區(qū)與非鏡區(qū)的穿梭次數(shù)(F(4,115)=5.914,P<0.001).與同性別對照組相比，0.04 mg/(kg·d)BPA顯著增加了雌鼠的穿梭次數(shù)(P<0.05)，提示BPA暴露可提高雌鼠的活動性.性別因素顯著影響小鼠鏡區(qū)停留時間(F(1,118)=3.965，P=0.049)，但不影響鏡區(qū)與非鏡區(qū)的穿梭次數(shù)(見圖5).

*表示與同性別對照組相比P<0.05；#表示與同處理雄性相比P<0.05
圖4 BPA暴露對成年小鼠明暗箱行為的影響(n=12)

*表示與同性別對照組相比P<0.05
圖5 BPA暴露對成年小鼠鏡子迷宮行為的影響(n=12)

2.3.4 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

雙因素方差分析表明，BPA暴露×性別交互作用顯著影響小鼠在高架十字迷宮開放臂的進(jìn)入次數(shù)(F(4,110)=5.113，P=0.01)和開放臂停留時間(F(4,110)=7.213,P<0.001).性別因素顯著影響小鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)(F(1,118)=6.104,P=0.015)、封閉臂停留時間(F(1,118)=33.011,P<0.001)和在中央?yún)^(qū)的抬頭次數(shù)(F(1,118)=5.46,P=0.021).正常小鼠開放臂停留時間和進(jìn)入次數(shù)具有性別差異(P<0.05)，表現(xiàn)為雄鼠高于雌鼠，表明正常雌鼠比雄鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的焦慮樣狀態(tài).然而，BPA暴露減少了雄鼠卻增加了雌鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)和開放臂停留時間，特別是0.4～40 mg/(kg·d)BPA暴露后，與同性別對照組間出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01和P<0.05)；同時，BPA微弱增加雄鼠而減少雌鼠封閉臂停留時間，誘導(dǎo)該參數(shù)的性別差異(P<0.05).這些結(jié)果提示，長期BPA暴露可增強(qiáng)雄鼠卻減弱雌鼠的焦慮樣狀態(tài)，并因此消除其性別差異，甚至逆轉(zhuǎn)雄鼠高于雌鼠焦慮狀態(tài)的性別差異(見表2).

表2 BPA暴露對成年小鼠高架十字迷宮行為的影響

注：與同性別對照組相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01;與雄性相比,#表示P<0.05,##表示P<0.01.

BPA暴露×性別交互作用、BPA暴露或性別因素均顯著影響小鼠在高架十字迷宮中開放臂和封閉臂的總進(jìn)入次數(shù)(F(4,110)=4.791,P=0.001;F(4,115)=3.275,P=0.014;F(1,118)=7.618,P=0.007).同時，BPA暴露因素顯著影響小鼠的封閉臂進(jìn)入次數(shù)(F(4,115)=3.673,P=0.008).正常小鼠開放臂和封閉臂總進(jìn)入次數(shù)表現(xiàn)出雄鼠高于雌鼠的性別差異(P<0.05)，表明正常雄鼠比雌鼠具有更高的活動性.但是，BPA暴露顯著減少了雄鼠進(jìn)入開放臂和封閉臂的總次數(shù)，特別是0.4和40 mg/(kg·d)BPA暴露組與同性別對照組間出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，提示長期BPA暴露可抑制雄鼠的活動性，并因此消除其性別差異(見表2).

3 討 論

焦慮行為是一種受性激素調(diào)節(jié)的情感行為，體內(nèi)正常的雌激素或雄激素水平是維持雌性或雄性動物良好情緒狀態(tài)的基礎(chǔ).本研究首次報道，長期暴露于低劑量(0.04～40 mg/(kg·d))雙酚A(BPA)可性別特異性地影響小鼠的焦慮樣行為，表現(xiàn)為加劇成年雄鼠的焦慮程度，減輕雌鼠的焦慮樣狀態(tài)，并消除甚至反向誘導(dǎo)這些行為的性別差異.許多研究證實(shí)了人和動物焦慮行為的性別差異,一般女性產(chǎn)生焦慮情緒的幾率大于男性.本研究采用多種模型檢測小鼠不同誘因?qū)е碌慕箲]樣狀態(tài)，也發(fā)現(xiàn)了雌鼠的焦慮情緒高于雄鼠的性別差異.高架十字迷宮檢測動物對新異環(huán)境的探究意愿和對高懸敞開臂恐懼而產(chǎn)生的焦慮情緒；鏡子迷宮和明暗箱檢測動物對鏡中自我影像或新異環(huán)境的好奇和畏懼而產(chǎn)生的焦慮情緒；曠場行為檢測動物對新異環(huán)境的探究意愿和畏懼心理而產(chǎn)生的焦慮情緒，理毛即為動物在沖突處境下無所適從而表現(xiàn)出的一種轉(zhuǎn)移行為[15].本研究發(fā)現(xiàn)，BPA主要影響小鼠在高架十字迷宮和曠場中的焦慮樣狀態(tài)，表現(xiàn)為顯著增加雌鼠而減少雄鼠的開放臂進(jìn)入次數(shù)和停留時間，BPA(0.4～4 mg/(kg·d))消除了小鼠在曠場中央?yún)^(qū)停留時間的性別差異.同時，明暗箱、鏡子迷宮和高架十字迷宮還檢測到BPA減少雄鼠的活動性，這與BPA增加雄鼠的焦慮狀態(tài)相符，因?yàn)橐话憬箲]狀態(tài)加劇的動物往往表現(xiàn)出活動減少.目前關(guān)于成年期BPA暴露對焦慮行為影響的研究很少.鑒于性激素對腦發(fā)育及其性別分化的重要作用，許多研究均聚焦在圍生期母體BPA暴露對子代成年后焦慮行為的影響,其中對雄性仔鼠的研究較多,發(fā)現(xiàn)無論妊娠期、哺乳期還是圍生期BPA暴露，成年后的雄性仔鼠在高架十字迷宮、明暗箱或曠場行為中幾乎都表現(xiàn)出加重的焦慮樣狀態(tài)[4,16-17]；Matsuda等[18]發(fā)現(xiàn)圍生期BPA暴露加劇雄性仔鼠成年后的焦慮樣狀態(tài)，但對雌鼠沒有影響；文獻(xiàn)[17,19]高架十字迷宮行為檢測結(jié)果表明，圍生期、出生早期、青春期BPA暴露加劇成年后雄性仔鼠卻減緩雌性仔鼠的焦慮樣狀態(tài).但洪星等[5]發(fā)現(xiàn)，妊娠期或哺乳期母體BPA暴露的雌/雄仔鼠成年后均表現(xiàn)出加重的焦慮樣狀態(tài).這些結(jié)果提示，長期BPA暴露對小鼠焦慮狀態(tài)的影響具有性別特異性，雄鼠對BPA更敏感，無論什么時期暴露均可對其焦慮行為產(chǎn)生負(fù)性的遠(yuǎn)期影響；而BPA對雌鼠的焦慮樣行為可能因暴露時期和劑量不同而產(chǎn)生不同的作用.本研究發(fā)現(xiàn)，BPA暴露顯著降低雄鼠腦和血清中的睪酮水平，但雌鼠血清和腦內(nèi)的雌二醇水平?jīng)]有明顯變化.這一發(fā)現(xiàn)與最近來自人群的研究相一致，即暴露于高濃度BPA的男性血清中游離睪酮水平下降[20].睪酮對于雄性動物腦功能的調(diào)節(jié)作用與雌激素對雌性動物的作用一樣重要.睪酮可正向調(diào)節(jié)雄性動物的情緒反應(yīng)，長期睪酮不足的雄鼠表現(xiàn)出抑郁和活動性減弱，而補(bǔ)充睪酮可以緩解性腺摘除小鼠的抑郁程度[21].文獻(xiàn)[22]發(fā)現(xiàn)BPA也作用于雄激素受體產(chǎn)生抗雄激素作用.因此，BPA對雄鼠的促焦慮作用可能與其抗雄激素作用有關(guān).雌激素調(diào)控認(rèn)知和情緒反應(yīng)主要通過雌激素β受體(ERβ)介導(dǎo)[23].例如，雌激素和ERβ激動劑DPN均可增加卵巢摘除雌鼠在高架十字迷宮開放臂的進(jìn)入次數(shù)和停留時間，表現(xiàn)出抗焦慮作用[24].另外，BPA還可表現(xiàn)出擬雌激素活性.例如：體外BPA單獨(dú)暴露可增加樹突絲運(yùn)動性和密度[25]；胚胎期BPA暴露劑量依賴性地增加新生鼠浦肯野氏細(xì)胞樹突分支的生長[26].本研究中BPA對雄鼠腦和血清中睪酮水平和雌鼠在鏡子迷宮中的穿梭頻率表現(xiàn)出低劑量抑制作用，而高劑量卻沒有影響，證實(shí)了低劑量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物劑量效應(yīng)的非線性作用關(guān)系.

綜上所述，長期低劑量BPA暴露可性別特異性地影響成年小鼠的焦慮行為，這可能和BPA的擬雌激素和抗雄激素活性有關(guān).因此，筆者下一步將在這些方面進(jìn)一步深入探討B(tài)PA影響小鼠焦慮情緒的可能機(jī)制.

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