擬南芥一氧化氮相關突變體在干旱脅迫下抗旱相關基因表達的研究*

劉建中， 張雙雙， 許 為

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

植物應對干旱等環(huán)境脅迫是通過基因表達的調控實現的[1-3].脫落酸(abscisic acid,ABA)在植物的生長發(fā)育中起著許多作用，其中最主要的功能是調控植物體內的水分平衡和耐逆性，這一點在多種ABA缺失突變體中被充分證明[4-5].在干旱脅迫時，植物體內會積累大量的ABA.ABA主要通過調控保衛(wèi)細胞來維持水分平衡[1,4-5].干旱脅迫時，ABA積累主要是通過激活ABA合成和抑制ABA降解實現的.幾種ABA合成的基因已經被克隆[6-8].ABA受體也已被克隆[9].ABA與受體結合，可解除蛋白磷酸酶2C(PP2C)對蔗糖非發(fā)酵相關蛋白激酶家族2(SnRK2)的抑制，從而使SnRK2磷酸化ABF2.ABF2的磷酸化可增強其結合ABA順式應答元件(ABA responsive element,ABRE)，啟動抗逆相關基因的表達[1-3].ABA途徑的啟動伴隨產生肌醇三磷酸(IP3)和環(huán)腺苷酸二磷酸核糖(cADPR)，激活胞內鈣庫中Ca2+的釋放.同時，胞外Ca2+也可經過質膜上的Ca2+通道內流，使胞內Ca2+濃度升高.另外,ABA還可誘導胞質堿化.胞內Ca2+和pH升高可激活胞內蛋白激酶/蛋白磷酸酶的活性，從而調節(jié)質膜上相關的離子通道，如激活質膜上相關的陰離子通道和K+外流通道，鈍化K+內流通道，從而誘導氣孔關閉或抑制氣孔開放[2-3,10].

NO(nitric oxide)是一種極其簡單的氣態(tài)小分子物質，容易透過細胞膜擴散進入細胞后發(fā)揮重要的功能[11].NO是哺乳動物中發(fā)現最早和研究最廣泛的信號分子之一[12].NO在植物中的作用直到20世紀90年代才引起植物學家們的關注，現已成為植物生物學領域的一個研究熱點[11-12].在植物中受NO調控的生物學過程包括種子萌發(fā)、葉片衰老、開花生理、氣孔關閉、細胞死亡及對病原菌的免疫反應[11-12].哺乳動物中NO的合成是通過NO合成酶(NOS)將精氨酸轉化為NO的[12].相比之下，植物中NO的生物合成則比較復雜[12].2003年，美國Crowford實驗室發(fā)現了一個可能的擬南芥NOS基因AtNOS1，atnos1突變體中NO的水平較野生型顯著降低[13].后來的研究發(fā)現AtNOS1并非一氧化氮合成酶，但其確實與NO在植物體內的積累相關，故其命名為一氧化氮相關蛋白1(NO-associated protein 1,AtNOA1)[14].AtNOA1屬于環(huán)狀鳥苷酸三磷酸酶(cGTPases)家族，定位于質體或線粒體上，在葉綠體的核糖體組裝和后續(xù)的mRNA翻譯成蛋白質過程中起重要作用[15].但AtNOA1與合成NO之間的關系還需進一步研究確定.在擬南芥突變體noa1中，NO的合成、植株生長發(fā)育和ABA誘導的氣孔關閉均受損[13].

NO在植物抗病、抗逆及生長發(fā)育等方面均起著重要的作用,但NO在植物抗旱或耐旱中的作用還不明確.已知干旱脅迫下ABA誘導的氣孔關閉在植物抗旱或耐旱中起著關鍵性作用[1-2].文獻[13]發(fā)現擬南芥nos1/noa1突變體葉片中ABA誘導的氣孔關閉的調節(jié)受損.據此推理，nos1/noa1在干旱條件下保持水分的能力降低，抗旱或耐旱性降低.然而，新近的報道表明擬南芥noa1-2及nia1nia2noa1-2突變體(NIA1及NIA2是通過硝酸鹽途徑合成NO的關鍵酶)的抗旱能力明顯高于野生型，而其抗旱能力的增強與ABA誘導氣孔的有效關閉及誘導抗旱相關基因的表達呈正相關[16].鑒于上述情況，有必要對NO在抗旱中的作用進行進一步的研究.

NO與半胱氨酸直接結合生成的亞硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,GSNO)是細胞內主要的NO供體.GSNO作為NO在細胞內的臨時儲蓄庫，可以將NO反式轉移到蛋白質半胱氨酸的巰基(—SH)上，即發(fā)生亞硝基化的反式轉移(trans-S-nitrosylation)[17].亞硝基谷胱甘肽還原酶(S-nitrosoglutathione reductase 1,GSNOR1)[18]和硫氧還原蛋白(thioredoxin,TRX)[19]是去亞硝基化的2個關鍵酶.gsnor1-3是一個GSNOR1功能缺失突變體，擬南芥GSNOR1參與調控植物生長發(fā)育和病原菌防御[20].但GSNOR1在抗旱中的作用還不清楚.

由于目前對NO信號分子在植物抗旱相關基因表達中的作用了解甚少，筆者系統(tǒng)地對8種不同類型共12個抗旱相關基因在干旱處理不同時間的擬南芥野生型和noa1及亞硝基谷胱甘肽還原酶功能缺失突變體gsnor1-3間的表達情況進行了分析.與已報道的結果不一致，本文的反轉錄PCR(RT-PCR)結果表明，抗旱相關基因的表達在不同基因型間無顯著差異，noa1的耐旱性與抗旱相關基因的表達無顯著的相關性.

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥Col-0(Columbia-0)生態(tài)型.NO相關突變體gsnor1-3由英國愛丁堡大學的Gary Loake教授[20]提供.noa1由美國加州大學圣地亞哥分校的Nigel Crowford教授[13]提供.

1.2 擬南芥培養(yǎng)

在無菌1.5 mL離心管中置入適量的種子，加入800 μL 100 g/L NaClO+1 g/L Tritron溶液，置于水平搖床上，輕輕搖動12 min左右，然后離心，去除上清;用800 μL重蒸餾水清洗種子5～8次，放置于4 ℃冰箱中3 d，破除種子休眠.將破除休眠的種子用移液器點在1/2MS培養(yǎng)基(pH 5.7)上，置于擬南芥生長室或光照培養(yǎng)箱(16 h光照,8 h黑暗;光照下22 ℃，黑暗下20 ℃；濕度80%)中.萌發(fā)5～6 d后將幼苗移入土中.

1.3 干旱處理與反轉錄PCR分析

長日照條件下生長3周的不同基因型擬南芥(Col-0，gsnor1-3,noa1)一次性澆足量的水，然后開始干旱處理.分別在干旱處理0，5，10和15 d時取蓮座葉用Trizol法提取總RNA，然后取等量總RNA用TOYOBO公司的反轉錄試劑盒進行反轉錄,在得到cDNA后進行PCR擴增.PCR所用的引物信息見表1.

表1 RT-PCR引物信息

2 結果與討論

長日照條件(光照,22 ℃，16 h；黑暗,20 ℃，8 h；濕度80%)下生長3周的擬南芥(Col-0，gsnor1-3,noa1)，每種材料均一次性澆足量的水，然后開始干旱處理.分別在斷水0，5，10和15 d時取蓮座葉提取總RNA,然后進行反轉錄得到cDNA，對已知的不同抗旱相關基因進行RT-PCR擴增，實驗結果如圖1所示.從RT-PCR結果可以看出，在斷水5 d時所有基因均無明顯的誘導表達，到10 d時大多數基因有較強的誘導表達.原因是在斷水5 d時植物還未遭受干旱脅迫，在斷水10 d時植物才經歷干旱脅迫.到干旱處理15 d時，大多數基因的誘導表達較10 d時下降，但只有個別基因的誘導表達在15 d時高于在10 d時.

各基因的表達情況總結如下：

1)RD29A/RD29B

RD29是干旱響應基因，首先由Yamaguchi-Shinozaki等[21]于1993年克隆出來.這兩個基因的轉錄受干旱和ABA高度誘導[21-24].RD29A啟動子中同時含有ABA順式應答元件(ABA responsive element,ABRE)和干旱應答元件(Dehydration responsive element,DRE)，而RD29B啟動子只有ABA順式應答元件(ABRE)[22-23].細胞缺水時，植物可以啟動RD29A的表達[21-24].將RD29啟動子和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)或luciferase等報告基因融合在一起導入擬南芥和煙草中,創(chuàng)制出的轉基因株系是研究干旱、ABA、冷害和高鹽等脅迫的良好指示性材料[25-26].

RD29A的表達量在各基因型中均較RD29B高.在干旱處理10 d時，在所有基因型中RD29A均有較強的誘導表達；但在gsnor1-3中的表達量在不同處理時間段均較Col-0和noa1低.RD29B僅在干旱處理10 d時的所有基因型中有較強的誘導表達,但表達量在基因型間無差異.

1為Col-0;2為gsnor1-3;3為noa1圖1 不同干旱處理時間抗旱相關基因在擬南芥不同基因型中的表達

2)DREB/CBF家族

DREB(dehydration responsive element binding protein)或C-重復結合因子(C-repeat binding factor，CBF)是與RD29A核心區(qū)域內的順式作用元件DRE相結合的轉錄因子，可以調控植物對干旱、低溫、高鹽等逆境應答相關基因的表達[1-3].DREB2蛋白翻譯后需受干旱等逆境脅迫激活才起作用[27].研究表明，DREB2A的中心存在一個負調控區(qū)域，刪除該負調控域后就可得到組成型的DREB2A(無需干旱等誘導激活)，可以調控許多脫水脅迫誘導基因的表達，并能顯著提高轉基因擬南芥在水分脅迫時的耐受性[28].

DREB1A/CBF3：在所有基因型中和不同干旱時間均有誘導表達，但在干旱處理15 d時表達量最高，且不同基因型間無顯著差異.

DREB1C/CBF2：在干旱處理前，在所有基因型中均有較低水平的表達；在斷水5 d時表達量下降至不可檢測水平；但干旱處理10 d時，誘導表達量較高；干旱處理15 d時表達量又下降.除了干旱處理15 d時在gsnor1-3中表達量較高外，其他時間段的表達量在各基因型間無差異.

DREB1D/CBF4：所有基因型中僅干旱處理15 d時有誘導表達.無論是在干旱處理前還是處理后，在gsnor1-3中的表達量均最低.

DREB2：僅Col-0在斷水5 d時有顯著的誘導表達.

3)NCED3

9-順-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoiddioxygenase,NCED) 是高等植物中ABA生物合成途徑中的一個關鍵酶[7-8].NECD催化的反應是ABA生物合成中的限速步驟，在擬南芥中過表達NCED3基因可以大大提高植株的耐旱性[8].NCED3在干旱處理10 d時有誘導表達，但其在所有基因型中的誘導表達均無顯著差異.

4)P5CS

1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)兼具γ-谷氨?；っ讣鞍?γ-谷氨酸脫氫酶(glutamic-gamma-semialdehyde dehydrogenase)的活性，催化與抗旱密切相關的脯氨酸生物合成的前兩步[29].在擬南芥所有基因型中，只在干旱處理10 d時有誘導表達，但在noa1中的表達量低于在Col-0和gsnor1-3中的表達量.

5)HK1

擬南芥組氨酸蛋白激酶1(histidine protein kinase,AHK1或HK1)是干旱、鹽及ABA信號途徑的正調控因子，其作用于DREB2A等蛋白的上游，分別通過依賴于和不依賴于ABA 的信號途徑調控脅迫反應[3,30].在干旱處理5和15 d時，其在noa1和gsnor1-3中的表達高于在Col-0中的表達.

6)LWT1

其功能是通過抑制脯氨酸脫氫酶(PDH)介導的脯氨酸降解實現在低溫和干旱脅迫下脯氨酸積累的增加，達到適應干旱脅迫.在干旱處理0及5 d時，LWT1在所有基因型中均無表達；在干旱處理10 d時，在所有基因型中均有高誘導表達，但在gsnor1-3中表達量最高；在干旱處理15 d時，在所有基因型中的表達量較干旱處理10 d時均有所下降，在Col-0中下降到幾乎不可檢測水平.

7)CKX1

降低細胞分裂素(cytokinin,CK)的水平可造成植物根系增大從而增強植物的抗旱性.細胞分裂素氧化酶/脫氫酶(cytokinin oxidase/dehydrogenase,CKX)是降解細胞分裂素的主要酶,過表達CKX可增強植物的抗旱和抗鹽性[31].在干旱處理前，在Col-0中有較強的表達，在noa1和gsnor1-3中的表達量較低；在干旱處理5 d時，在所有基因型中的表達量均下降；在干旱處理10 d時，在所有基因型中均有較強的誘導表達，但其表達量在不同基因型間無顯著差異；干旱處理15 d時，表達量下降到干旱處理5 d時的水平.

8)MMS21

擬南芥MMS21是一個SUMO E3連接酶，對擬南芥抗旱性起負調控作用.mms21突變體抗旱性增強，而過表達MMS21則降低擬南芥的抗旱性[32].無論是在干旱處理前還是處理后，其表達量在gsnor-3中均高于在Col-0和noa1中；而其表達在Col-0和noa1間無顯著差異.

從以上基因的表達情況來看，noa1的耐旱性并不與這些抗旱相關基因的表達顯著相關.僅HK1在干旱處理5和15 d時，在noa1中的表達量高于在Col-0中的表達量.而gsnor1-3對干旱的敏感性則與RD29A和CBF4/DREB1D的誘導表達降低相關.但CBF2/DREB1C，LWT1，MMS21在gsnor1-3中的表達量高于在Col-0 和noa1中的.文獻[16]報道RD29B基因在有或無ABA處理的情況下在noa1-2突變體中的表達均高于在野生型中的表達.而本文的結果表明RD29B基因的表達在干旱處理前后在noa1突變體與野生型間無顯著差異(見圖1).造成與文獻[16]報道結果不一致的原因，可能與本實驗和文獻[16]所用材料的生長發(fā)育時期、生長條件、誘導基因表達方法的不同有關.另，筆者研究的同盆及異盆抗旱實驗結果表明，所用基因型植株大小對抗旱鑒定的結果至關重要(待發(fā)表).noa1植株及葉片較小，在干旱條件下通過蒸騰作用失水較少，可能是其在異盆實驗中較野生型耐旱的主要原因.

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