雄甾-4-烯-3,17-二酮的濃硫酸乙酸酐分光光度測定

汪文俊，劉 妍

(中南民族大學 生命科學學院， 武漢 430074)

雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-androstene-3,17-dione，簡稱雄烯二酮或4-AD)是甾體激素類藥物不可替代的中間體，幾乎所有甾體激素藥物都能以4-AD為起始原料生產[1].作為前體，4-AD能繼續(xù)合成類皮質素、雌激素、雄激素等甾體類激素藥物，是目前激素類中間體研究的熱點[2].

目前4-AD的測定方法主要有薄層層析法、氣相色譜法、高效液相色譜法和毛細色譜法等[3-7].薄層層析法準確度不高且操作時間長，色譜法因其測定準確、靈敏度高而被普遍采用，但設備使用維護昂貴，多樣品時操作時間長，儀器超負荷運轉.依據4-AD在酸性條件下可轉化為烯醇式結構，能與醋酐、濃硫酸發(fā)生特征性顏色反應(Lieberman反應)的性質[8]，本文采用濃硫酸-乙酸酐為反應溶劑，利用分光光度計探討了4-AD快速而準確測定的方法，該法測定結果準確、耗時短、費用低、節(jié)約成本，具有良好的應用前景.

1 材料與方法

1.1 試樣和儀器

雄甾-4-烯-3,17-二酮標準品(SIGMA)，測試樣為本室保存菌種Mycobacteriumneoaurum轉化植物甾醇所得4-AD萃取液，參見文獻[8].濃硫酸、乙酸酐、乙酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司)，所有試劑均為分析純.紫外分光光度計(UV-2000, 尤尼柯上海儀器有限公司)，電子分析天平(ALC-310.3, ACCULAB)，高效液相色譜儀(UltiMate 3000, 戴安公司).

1.2 溶液的配制

乙酸乙酯-濃硫酸溶液的制備：量取150 mL乙酸乙酯，緩慢加入濃硫酸10 mL，混合均勻. 4-AD標準溶液的制備：精確稱取4-AD標準品80 mg，用上述乙酸乙酯-濃硫酸溶液40 mL溶解，配成2.0 mg/mL的4-AD標準溶液.

1.3 濃硫酸乙酸酐法測定4-AD

1.3.1 標準品紫外掃描

取3 mL 4-AD標準溶液于比色皿中，用紫外分光光度計進行紫外掃描，以確定4-AD的最大吸收峰.

1.3.2 線性范圍

精密吸取4-AD標準液0.2, 0.4 ,0.6 ,0.8 ,1.0,1.2 mL于試管中，分別用體積比為15︰1的乙酸乙酯-濃硫酸溶液稀釋至3 mL，搖勻，加入2 mL乙酸酐，輕輕振搖，室溫下反應15 min，用1 cm石英比色皿，在上述確定的波長下測定吸光度.空白對照為乙酸乙酯-濃硫酸溶液3 mL，其余操作同前.根據吸光度(y)和濃度(x)關系繪圖，得4-AD的線性范圍、回歸方程和相關系數.

1.3.3 精密度

精密度指用該方法重復測定同一均質樣品所得的測定值彼此接近程度，表示分析結果的重復性，常用相對標準偏差(RSD)表示.

(1)

按上述方法，在同一天內連續(xù)5次測定混合標準溶液，以各組分的吸光值，計算相對標準偏差.

1.3.4 準確度

準確度是指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率(%)表示(2).準確度應在規(guī)定的范圍內測試，用于定量測定的分析方法均需做準確度驗證.

(2)

取4-AD標準品 2 mg，采用與待測樣品相同的處理方法制備樣品，重復測定5次.利用外標法計算出4-AD的值，進而計算出4-AD的回收率(%)和平均回收率.

1.3.5 穩(wěn)定性

精確吸取4-AD標準液1 mL，用乙酸乙酯-濃硫酸溶液稀釋至3 mL，搖勻，加入2 mL乙酸酐，輕輕振搖，室溫下反應15 min，密封保存，分別于0 , 0.5 ,1 , 1.5 , 2 h測定吸光度.

1.3.6 樣品的測定

取3個試管，分別加入1 mL甾醇轉化液，再用3 mL乙酸乙酯萃取后取上清備用.分別取1mL上清液在沸水浴中將其蒸干，冷卻至室溫，加15︰1的乙酸乙酯濃硫酸3 mL，充分振搖使其完全溶解.其余操作與標準曲線制作法相同.利用標準曲線線性方程計算樣品溶液中4-AD的質量濃度(mg/mL).上述樣品采用HPLC進行測定，方法見文獻[8].

2 結果與討論

2.1 波長的選擇

4-AD在濃硫酸存在下能發(fā)生酮式、烯醇式互變轉化生成烯醇式結構，從而與乙酸酐、濃硫酸發(fā)生特征性顏色反應( Lieberman反應) .在紫外分光光度計上對4-AD的標準溶液進行紫外掃描，因吸收波長小于220 nm時，吸收干擾較大，故選定大于220 nm的波長對4-AD標準品進行全波長掃描，結果如圖1所示，圖1中4-AD在312 nm處有最大吸收峰，故選定4-AD的檢測波長為312 nm.

2.2 濃硫酸乙酸酐法測定4-AD

2.2.1 濃硫酸乙酸酐法線性檢測

在波長312 nm下，對不同濃度的4-AD標準品測定吸光度，以驗證濃硫酸乙酸酐法的線性，結果如圖2所示.由圖2算得4-AD的回歸方程為：y= 0.714x(y為吸光值，x為4-AD濃度)，相關系數R2= 0.9993.說明在0.08～0.48 mg/mL范圍內，4-AD的吸光值與濃度的線性關系良好.

λ/nm圖1 4-AD標準品的紫外全波長掃描圖Fig.1 The scanning curve of 4-AD standard under ultraviolet broad spctrum

ρ(4-AD)/(mg·mL-1)圖2 4-AD標準曲線Fig.2 The 4-AD standard curve analysis

2.2.2 精密度試驗

在波長312 nm下，在0.08 ～ 0.48 mg/mL范圍內，選取樣品濃度為0.48 mg/mL，通過測定其吸光值，研究了測定結果的精密度實驗，結果見表1.由表1可算得4-AD的RSD為0.672%，說明該方法精密度較高.

2.2.3 準確度試驗

在波長312 nm下，加入2.00 mg標準品，按上述方法配置成濃度為0.40 mg/mL的標準溶液，在0.08～0.48 mg/mL范圍內，測定其吸光值，研究了測定結果的準確度實驗，結果如表2所示.可見4-AD的平均回收率為99.69%，說明該方法準確度較高，可滿足科研工作及生產中常規(guī)測定的要求.

2.2.4 穩(wěn)定性驗證

在波長312 nm下，在0.08～0.48 mg/mL范圍內，選取樣品濃度為0.40 mg/mL，通過測定其吸光值，研究了測定結果的穩(wěn)定性實驗，結果如表3所示.表3中可見RSD為1.968%，表明供試品溶液在2 h內是穩(wěn)定的.

表1 4-AD精密度

表2 4-AD回收率

表3 穩(wěn)定性試驗結果Tab.3 Results of stability test

2.2.5 樣品測定

在波長312 nm下，對樣品含量進行測定，測得樣品的濃度分別為：1.548, 1.545, 1.547 mg/mL樣品測得的含量相差不大，平均濃度為(1.547±0.002) mg/mL，與HPLC測定結果(1.545±0.002) mg/mL相比，p>0.05，無顯著差異，說明該法可用于樣品的測定，結果可靠，可用于將來的工業(yè)化生產中的常規(guī)測試.

3 結語

本文建立的雄甾-4-烯-3,17-二酮的濃硫酸乙酸酐-分光光度法，利用其Lieberman反應，在312 nm處有最大吸收值的特征，通過測定吸光值，獲得標準曲線線性關系良好，回收率較高，精密度良好，樣品檢測結果與HPLC檢測結果之間差異不顯著，可用此法于雄甾-4-烯-3,17-二酮的檢測，具有良好的應用前景.

參 考 文 獻

[1] Garrido M,Bratoeff E,García-Lorenzana M,et al. Biological evaluation of androstene derivatives[J]. Arch Pharm,2013, 346(1):62-70.

[2] 袁東超, 董艷苓, 杜連祥.分枝桿菌降解大豆甾醇側鏈的發(fā)酵研究[J].天津輕工業(yè)學院學報, 2003, 18(4):11-23.

[3] Wenqing Zhang, Minglong Shao, Zhiming Rao, et al. Bioconversion of 4-androstene-3,17-dione to androst-1,4-diene-3,17-dione by recombinant Bacillus subtilis expressing ksdd gene encoding 3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase from Mycobacterium neoaurum JC-12[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2013,135:36-42.

[4] Andrási N. Helenkár A, Vasanits-Zsigrai A,et al. The role of the acquisition methods in the analysis of natural and synthetic steroids and cholic acids by gas chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A,2011,1218(45):8264-8272.

[5] Onuchak L A, Kudryashov S Y, Arutyunov Y I,et al. Influence of flow parameters of the mobile phase on the retention and thermodynamic characteristics of sorption in gasliquid chromatography[J]. Russ J Phys Chem, 2006, 80(8): 1315-1320.

[6] Matsuoka C, Nohta H, Kuroda N, et al. Simultaneous determination of cholestanol and cholesterol in human serum by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection[J]. J Chromatogr, 1985,42(14): 432-436.

[7] Muskiet F A J. Cappillary gas chromatographic profiling of total long chain fatty acids and cholesterol in biological materials[J]. J Chromatogr, 1983, 29(9): 231-244.

[8] Wang W J, Yu L. Preparation, characterization, and biotransformation of the inclusion complex of phytosterols and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin by Mycobacterium neoaurum[J]. Z Naturforsch C, 2011, 66 (5/6):277-282.