尖鐮胞菌細(xì)胞色素P450 55a1基因超表達(dá)載體的構(gòu)建和水稻日本晴遺傳轉(zhuǎn)化

吳云華，鄧 歡

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430074)

一氧化氮(NO)是一類可擴(kuò)散的脂溶性小分子物質(zhì)，廣泛存在于生物體內(nèi)，易于在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間擴(kuò)散[1].NO在植物體內(nèi)可自身合成，或通過酶促和非酶促反應(yīng)進(jìn)行[2].它作為植物體中的信使分子對(duì)植物的光形態(tài)建成[3]、呼吸作用和根的生長(zhǎng)發(fā)育[4]起重要的作用，同時(shí)對(duì)植物進(jìn)行各種生物脅迫[5](如病蟲害)和非生物脅迫[6](如干旱、鹽脅迫、低溫及重金屬)的信息傳遞中也發(fā)揮了重要作用.但目前關(guān)于NO在各種生理?xiàng)l件下對(duì)水稻幼苗影響的研究較少，尖鐮胞菌CYP55A1是一類具有NO還原作用的酶系，故也被稱為一氧化氮還原酶細(xì)胞色素P450(CYP450)[7]，本實(shí)驗(yàn)選取cyp55a1基因作為研究對(duì)象，對(duì)水稻日本晴進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，為研究該基因功能和NO對(duì)水稻的生理作用提供實(shí)驗(yàn)材料.

1 材料和方法

1.1 材料

Cyp55a1基因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)由尖鐮胞菌中克隆得到，表達(dá)載體pCAMBIA1302、水稻日本晴的種子，大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌EHA105宿主菌株均由中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.

限制性內(nèi)切酶、pyrobest DNA聚合酶、DNA Marker、T4連接酶(TAKARA公司)，DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)，酵母粉、胰蛋白胨、總RNA提取試劑Trizol、羧芐(invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace-α-TM, 日本TOYOBO公司)，瓊脂糖(FMC公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑分析純.引物由南京金斯瑞公司合成.

1.2 pCAMBIA1302-cyp55a1植物表達(dá)載體的構(gòu)建

用SDS堿裂解法提取pCAMBIA1302空載體質(zhì)粒和用Trizol試劑提取尖鐮胞菌的總RNA并將其反轉(zhuǎn)得到其cDNA.用設(shè)計(jì)的特異性引物(見表1)以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.再將擴(kuò)增產(chǎn)物與pCAMBIA1302空載體質(zhì)粒用NcoI和SpeI同時(shí)進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶將二者連接6 h.

表1 引物序列

其中R1比R2多一個(gè)終止密碼子，目的是為了阻止載體下游的GFP蛋白表達(dá)，防止GFP融合蛋白對(duì)CYP蛋白的功能造成影響.共構(gòu)建2個(gè)雙元表達(dá)載體：pCAMBIA1302-cyp55a1-gfp1和pCAMBIA1302-cyp55a1.

圖1 載體pCAMBIA1302-cyp55a1構(gòu)建流程圖Fig.1 The flow diagram for the construction of vector pCAMBIA1302-cyp55a1

1.3 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化

參考李毓等[8]的方法，利用實(shí)驗(yàn)室中保存好的成熟的野生型日本晴種子進(jìn)行誘導(dǎo)2～3周及繼代培養(yǎng)4～6 d，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染胚性愈傷，共培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行篩選.2～3周后更換一次篩選培養(yǎng)基，2周后將長(zhǎng)有白色抗性愈傷的進(jìn)行分化培養(yǎng)，直到分化出綠色的小幼苗.將綠色幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，待植株長(zhǎng)到瓶口處、根系發(fā)達(dá)后，打開瓶口加入一定量的無菌水進(jìn)行煉苗，約1周后移栽到實(shí)驗(yàn)田.

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性鑒定

采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以cyp55a1基因的引物進(jìn)行PCR檢測(cè).電泳產(chǎn)物取3 μL進(jìn)行檢測(cè).

1.5 陽(yáng)性植株的RT-PCR

采用Trizol法提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的總RNA，利用TOYOBO Rerver Tra Ace-α-TM 試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成 cDNA.用內(nèi)參18sRNA引物對(duì)cDNA模板進(jìn)行PCR鑒定，再按一定比例稀釋.用設(shè)計(jì)cyp55a1基因的RT-PCR引物和18sRNA引物同時(shí)對(duì)cDNA模板進(jìn)行RT-PCR.

2 結(jié)果及分析

2.1 載體構(gòu)建

構(gòu)建的cyp55a1載體用引物F和R做PCR鑒定，cyp55a1-1302載體用NcoI內(nèi)切酶和SpeI內(nèi)切酶做雙酶切鑒定，cyp55a1基因?yàn)?203 bp， 2個(gè)載體均為陽(yáng)性，測(cè)序結(jié)果正確.

2.2 遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株T0代的鑒定

將構(gòu)建好的pCAMBIA1302-cyp55a1超表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染日本晴的愈傷組織，經(jīng)過誘導(dǎo)、篩選、分化、生根、煉苗，然后種植于田間.

取約5 cm的幼嫩葉片，以CTAB法提取基因組DNA為模板，使用cyp55a1引物(F，R)，以轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA1302得到的轉(zhuǎn)基因日本晴為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR檢測(cè)，鑒定T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，共獲得了13株陽(yáng)性苗(部分鑒定結(jié)果見圖4).

2.3 陽(yáng)性植株的RNA水平的檢測(cè)

2.3.1 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株幼苗RNA的提取及cDNA檢查

取5 cm左右的嫩葉，用Trizol試劑提取其總RNA(見圖5a)，電泳可見清晰的3條主帶，說明轉(zhuǎn)基因植株幼苗RNA提取成功.利用 TOYOBO Rerver Tra Ace-α-TM 試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA.用內(nèi)參18sRNA引物對(duì)cDNA模板進(jìn)行PCR鑒定(見圖5b)，從圖5b可見單一的目的條帶，大小與預(yù)測(cè)相符，結(jié)果表明cDNA反轉(zhuǎn)成功，可用于RT-PCR實(shí)驗(yàn).

a) 總RNA電泳圖; b) cyp55a1目的片段PCR擴(kuò)增電泳圖; c) cyp55a1/1302重組質(zhì)粒DNA電泳圖，1為空載1302;d) cyp55a1/1302重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖; e) pCAMBIA1302-cyp55a1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌后的質(zhì)粒PCR鑒定電泳圖圖2 重組質(zhì)粒鑒定圖Fig.2 Identification of recombinant plasmid

a)水稻胚性愈傷組織誘導(dǎo)；b)愈傷組織繼代培養(yǎng)；c)抗性愈傷組織篩選；d)愈傷組織分化成苗；e)轉(zhuǎn)化植株生根成苗圖3 遺傳轉(zhuǎn)化的過程圖Fig.3 Procedures of genetic transformation

a) T0代植株幼苗基因組DNA結(jié)果; b) T0代植株的PCR陽(yáng)性鑒定圖4 T0代植株DNA提取及PCR陽(yáng)性鑒定Fig.4 DNA extraction and positive identification of T0 generation plant by PCR

a) 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株幼苗總RNA的電泳圖; b) RNA反轉(zhuǎn)得到的cDNA的PCR電泳圖(內(nèi)參18sRNA引物)圖5 陽(yáng)性植株RNA的提取和反轉(zhuǎn)cDNA的檢測(cè)Fig.5 RNA extraction and cDNA testing of T0-generation

2.3.2 T0代陽(yáng)性植株cyp55a1-ORF表達(dá)量的相對(duì)定量分析

按一定比例稀釋cDNA模板，用設(shè)計(jì)的RT-PCR引物55a1(F、R)和18sRNA引物(F、R)同時(shí)對(duì)cDNA模板進(jìn)行RT-PCR. 結(jié)果表明，相比轉(zhuǎn)空載得到的日本晴植株，陽(yáng)性植株的cyp55a1基因的表達(dá)水平得到不同程度的上調(diào)(見圖6)，說明cyp55a1基因在陽(yáng)性植株中得到了表達(dá)，其中cyp55a1-A1-1,cyp55a1-A2-5,cyp55a1-A2-6和cyp55a1-A2-7這4個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中cyp55a1基因表達(dá)較高，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)材料.

圖6 To代陽(yáng)性植株的RT-PCR結(jié)果Fig.6 RT-PCR results of T0 generations positive plants

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)成功地將cyp55a1基因克隆到植物過表達(dá)載體pCAMBIA1302中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了多個(gè)轉(zhuǎn)基因植株.對(duì)這些轉(zhuǎn)植株進(jìn)行陽(yáng)性鑒定和RNA水平表達(dá)量分析，結(jié)果表明：cyp55a1基因已成功插入到水稻基因組中，獲得了多個(gè)高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株.本實(shí)驗(yàn)獲得的高表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株為cyp55a1基因功能和NO對(duì)水稻生理作用的后續(xù)研究提供了實(shí)驗(yàn)材料.

參 考 文 獻(xiàn)

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