siRNA沉默F(xiàn)ANCD2基因增加肺癌A549／DDP細(xì)胞對順鉑化療的敏感性

姜賀果，戴春華，李堅，陳永昌，藍(lán)婷，伍敏

（1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

siRNA沉默F(xiàn)ANCD2基因增加肺癌A549／DDP細(xì)胞對順鉑化療的敏感性

姜賀果1，戴春華1，李堅1，陳永昌2，藍(lán)婷2，伍敏2

（1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：研究siRNA沉默F(xiàn)ANCD2基因后人肺腺癌A549／DDP耐藥細(xì)胞株對順鉑（DDP）耐藥性的變化。方法：合成針對FANCD2基因的siRNA（FANCD2-siRNA），采用脂質(zhì)體將其分別轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞株和A549／DDP耐藥細(xì)胞株。CCK-8法測定經(jīng)DDP處理的A549和A549／DDP細(xì)胞株轉(zhuǎn)染siRNA前后的細(xì)胞增殖率變化；免疫印跡法測定2種細(xì)胞株轉(zhuǎn)染siRNA前后FANCD2蛋白單泛素化水平；免疫熒光測定胞核中FANCD2蛋白核聚小體的形成。結(jié)果：經(jīng)DDP處理的A549／DDP細(xì)胞增殖率，F(xiàn)ANCD2蛋白單泛素化水平及核聚小體形成程度明顯高于A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染FANCD2-siRNA后，A549和A549／DDP細(xì)胞的FANCD2蛋白單泛素化水平和核聚小體形成明顯降低，細(xì)胞增殖率顯著下降。結(jié)論：應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默F(xiàn)ANCD2基因可抑制FA／BRCA途徑的DNA修復(fù)功能，從而增加肺癌細(xì)胞對DDP的敏感性，部分逆轉(zhuǎn)耐藥肺癌細(xì)胞株對DDP的耐藥性。

肺癌細(xì)胞；順鉑；耐藥性；FA／BRCA途徑；FANCD2；siRNA

肺癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率均居各種惡性腫瘤的首位。順鉑（DDP）是肺癌各種化療方案中的基本藥物，其作用機制是結(jié)合于DNA鏈，致其雙鏈交聯(lián)和斷裂，阻滯其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷和凋亡。DDP具有抗癌譜廣、抗癌作用強等特點，但其日益增高的腫瘤耐藥性和毒副作用限制了臨床的廣泛應(yīng)用。既往研究顯示，腫瘤細(xì)胞對DDP耐藥包含多種機制：銅轉(zhuǎn)運蛋白CTR1表達(dá)下降；谷胱甘肽解毒作用增強；細(xì)胞表面P-糖蛋白多藥耐藥轉(zhuǎn)運體表達(dá)升高；細(xì)胞DNA損傷修復(fù)功能增強，包括核苷酸切除修復(fù)（NER）、堿基切除修復(fù)（BER）、同源重組修復(fù)（HRR）、非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)等［1－2］。近來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A／BRCA途徑參與腫瘤細(xì)胞對DDP的耐藥。

范可尼貧血癥（Fanconi anemia，F(xiàn)A）是一種以多發(fā)性先天畸形，進(jìn)行性骨髓衰竭，高度腫瘤易感性為特點的罕見遺傳性疾病，患者體細(xì)胞FA／BRCA途徑均有不同類型的基因突變，表現(xiàn)為對DNA交聯(lián)劑類化療藥物極為敏感［3］。作為機體修復(fù)DNA損傷的的信號通路之一，完整的FA途徑在DNA交聯(lián)損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用［4］。目前已證實FA蛋白至少由13個FA互補基因編碼（FANC-A，B，C，D1，D2，E，F(xiàn)，G，I，J，L，M，N），其中D2編碼該途徑核心蛋白FANCD2。FANCD1（即BRCA2）、J、N為下游基因，其余為上游基因［4－5］。上游基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和3種FA相關(guān)蛋白組成FA核心復(fù)合體，其主要功能是單泛素化FANCD2和FANCI［6－7］，這一核心過程是BRCA1依賴性的，因此FA途徑又稱為FA／BRCA途徑。FANCD2蛋白經(jīng)泛素化后，從相對分子質(zhì)量為155 000的小片段（S），修飾為162 000的大片段（L）［8］，兩者之比（L／S）反應(yīng)FANCD2蛋白單泛素化水平。

本實驗采用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默肺癌細(xì)胞株FA／BRCA途徑關(guān)鍵基因FANCD2，通過觀察肺癌細(xì)胞株對DDP敏感性的變化，研究FANCD2蛋白在肺癌細(xì)胞對DDP耐藥中的作用，探討通過抑制FA／BRCA途徑中FANCD2基因的表達(dá)逆轉(zhuǎn)A549／DDP細(xì)胞株對DDP耐藥性的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株（A549、A549／DDP）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；高糖DMEM、胎牛血清購自美國Gibco公司；DDP購自江蘇豪森制藥有限公司；siRNA套裝購自廣州銳博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；DMSO、Triton X-100購自美國Sigma公司；β-肌動蛋白、FANCD2蛋白抗體購自美國Santa Cruz公司；低聚甲醛、羊抗小鼠二抗、CY3熒光標(biāo)記羊抗鼠二抗購自北京康為世紀(jì)公司；PVDF膜，牛血清白蛋白（BSA）購自瑞士Roche公司；ECL發(fā)光劑購自美國Millipore公司；DAPI購自美國Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549、A549／DDP細(xì)胞株置于含10%熱滅活胎牛血清、青霉素（100 U／mL）、鏈霉素（100μg／mL）的DMEM中，A549／DDP培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為1μg／mL的DDP，于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的A549、A549／DDP細(xì)胞接種于6孔板，每孔1×106個細(xì)胞。培養(yǎng)12 h后換用無血清培養(yǎng)基饑餓12 h。siRNA轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol／L。按照siRNA試劑盒說明書，將含F(xiàn)ANCD2-siRNA的LipofectamineTM2000與siRNA儲存液各5μL分別溶于250μL不含抗生素的無血清DMEM中，室溫孵育5 min。輕搖混勻轉(zhuǎn)染試劑與siRNA儲存液，室溫孵育20 min后，加入培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基終體積為2 mL。轉(zhuǎn)染6 h后，換用含10%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8法測定細(xì)胞增殖率 取對數(shù)生長期、經(jīng)FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染成功前后的A549、A549／DDP細(xì)胞，消化離心后接種于96孔板中，每孔細(xì)胞2×103個，培養(yǎng)24 h，將DDP質(zhì)量濃度梯度分別為0、1.25、2.5、5、10、20μg／mL的系列培養(yǎng)基100μL分別加入對應(yīng)的孔，其中0μg／mL為陰性對照組，同時設(shè)立空白孔（含培養(yǎng)基不含藥物與細(xì)胞）進(jìn)行校正，每組樣本6個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48 h后，于對應(yīng)孔加入CCK-8試劑10μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔光密度（D）值。細(xì)胞增殖率＝［（D實驗組－D空白孔）／（D陰性對照組－D空白孔）×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測肺癌細(xì)胞FANCD2蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期、經(jīng)FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染成功前后的A549、A549／DDP細(xì)胞接種于6孔板，每孔2.5×106個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。經(jīng)含DDP質(zhì)量濃度分別為0、1.25、2.5、5、10、20μg／mL的培養(yǎng)基2 mL處理24、48 h后，棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗2遍，加入煮沸的2×SDS上樣緩沖液100μL，收集細(xì)胞總裂解物，100℃煮沸5 min，超聲破碎1 min，4℃，12 000×g離心10 min。將蛋白樣品行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。一抗鼠抗人FANCF單克隆抗體（1∶100）、鼠抗人FANCD2單克隆抗體（1∶200）4℃孵育過夜。二抗羊抗鼠IgG（1∶2 000）室溫孵育1 h，β-肌動蛋白（1∶10 000）室溫孵育1 h。ECL發(fā)光劑顯色，Typhoon分子成像系統(tǒng)分析灰度，以FANCD2／β-肌動蛋白比值表示FANCD2蛋白的相對含量。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 免疫熒光法檢測FANCD2核聚小體表達(dá)取經(jīng)FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染成功前后的對數(shù)生長期A549、A549／DDP細(xì)胞，每孔5×105個細(xì)胞。設(shè)空白培養(yǎng)組，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。5μg／mLDDP分別處理24、48 h，PBS洗2遍；每孔加入200μL 4%低聚甲醛，固定細(xì)胞30 min，PBS洗30 min；300μL 0.3%Triton X-100透膜作用20 min，PBS洗30min；500μL 3%BSA室溫孵育1 h，PBS洗30 min；200 μL FANCD2一抗4℃過夜，PBS洗15 min；熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS避光洗15 min；DAPI染核20 min，PBS暗處洗15 min；熒光顯微鏡下觀察熒光強度。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DDP對A549和A549／DDP細(xì)胞株轉(zhuǎn)染前后的增殖抑制作用

A549和A549／DDP細(xì)胞株轉(zhuǎn)染FANCD2-siRNA24 h和48 h后，IC50均較轉(zhuǎn)染前明顯降低（P均＜0.05）。見表1。

FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染前，除1.25μg／mL DDP外，其他質(zhì)量濃度DDP處理后的A549／DDP細(xì)胞增殖率在24 h和48 h均明顯高于A549細(xì)胞（P均＜0.05）。FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染后，經(jīng)DDP處理的A549／DDP細(xì)胞增殖率在24 h和48 h也明顯高于A549細(xì)胞（P均＜0.05）。此外，A549和A549／DDP細(xì)胞增殖率在FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染后24 h和48 h均分別低于其siRNA轉(zhuǎn)染前（P均＜0.05）。結(jié)果表明，2種肺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染FANCD2-siRNA前后的細(xì)胞增殖率均隨DDP質(zhì)量濃度的增高而降低，呈劑量依賴性；同時，隨DDP作用時間的延長而降低，呈時間依賴性。見圖1。

圖1 FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染前后DDP抑制肺癌細(xì)胞增殖率的劑量 效應(yīng)曲線與時間 效應(yīng)曲線

表1 siRNA轉(zhuǎn)染前后肺癌細(xì)胞經(jīng)DDP處理后的IC50 μg／m L

2.2 FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染前后肺癌細(xì)胞FANCD2單泛素化水平

A549細(xì)胞經(jīng)梯度DDP處理24 h和48 h后，F(xiàn)ANCD2蛋白長短片段之比（L／S）隨DDP質(zhì)量濃度升高而降低，與0μg／mL比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），僅在20μg／mL DDP處理24 h后L／S較0μg／mL增加（P＜0.05，圖2A）。

A549／DDP經(jīng)梯度DDP處理24 h和48 h后L／S隨DDP質(zhì)量濃度升高而升高，除在2.5μg／mL DDP處理24 h后L／S比值較0μg／mL降低外（t＝4.327，P＝0.049），其余各質(zhì)量濃度DDP處理24 h和48 h后FANCD2蛋白總量及L／S比值較0μg／mL明顯升高（P均＜0.05，圖2B），表明FANCD2單泛素化水平增高。

經(jīng)FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染后，除A549／DDP細(xì)胞經(jīng)5μg／mL DDP處理24 h后，L／S比值與轉(zhuǎn)染前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝0.632，P＝0.562），其余各質(zhì)量濃度DDP處理A549和A549／DDP細(xì)胞24 h后的FANCD2蛋白總量及L／S比值均較對照組明顯降低（P均＜0.05，圖2C），表明FANCD2單泛素化水平降低。

圖2 FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染前后肺癌細(xì)胞株經(jīng)DDP處理后的FANCD2單泛素化水平（L／S）

2.3 FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染前后肺癌細(xì)胞FANCD2核聚小體的表達(dá)

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，A549細(xì)胞經(jīng)5μg／mL DDP處理24 h和48 h后，及FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染后再經(jīng)5μg／mL DDP處理24 h，胞核內(nèi)核聚小體表達(dá)無明顯改變。A549／DDP細(xì)胞經(jīng)5μg／mLDDP處理24 h和48 h后，胞核內(nèi)FANCD2核聚小體表達(dá)增強（核聚小體形成）；FANCD2-siRNA轉(zhuǎn)染后，經(jīng)5 μg／mL DDP處理24 h，胞核內(nèi)FANCD2核聚小體表達(dá)明顯降低。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞胞核內(nèi)FANCD2核聚小體的表達(dá)

3 討論

DDP作為肺癌治療方案中的一線化療藥物，屬于廣譜細(xì)胞周期非特異性抗癌藥物，可入核共價結(jié)合于DNA復(fù)制叉位置，形成鏈間交聯(lián)（85%～90%）和鏈內(nèi)交聯(lián)（1%～2%）以及單加合物［6，10］，阻滯DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，其中以鏈內(nèi)交聯(lián)的阻滯作用最強。研究表明，多種經(jīng)典DNA修復(fù)，包括NER、BER、HRR、NHEJ等均不同程度地參與鉑類藥物所致DNA損傷的修復(fù)［8，11－13］。鏈內(nèi)交聯(lián)的修復(fù)幾乎完全依賴FANCD2蛋白的單泛素化能力［14］，具有完整FA／BRCA途徑功能的腫瘤細(xì)胞經(jīng)DDP處理后，在S期被激活，表現(xiàn)為FA／BRCA途徑上游的各種蛋白高表達(dá)，繼而FANCD2單泛素化水平升高，DNA修復(fù)能力增強，此即為腫瘤細(xì)胞對DDP耐藥的重要分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

FA／BRCA途徑被激活時，上游的8個基因（FANC-A，B，C，E，F(xiàn)，G，L，M）編碼的蛋白與多個FA／BRCA途徑相關(guān)蛋白組成FA核心復(fù)合體，然后在泛素化結(jié)合酶（E2）作用下單泛素化FANCD2和FANCI，形成ID復(fù)合體，并與下游蛋白FANCJ、FANCN、BRCA1、BRCA2以及RAD51，ATR等相互作用，共定位于DNA損傷部位形成核聚小體，進(jìn)而作用于FA／BRCA途徑下游基因，使NER、HRR等途徑被激活，啟動并共同參與DDP等交聯(lián)劑類化療藥物所致DNA損傷的修復(fù)［8，11－13］。多項研究表明，F(xiàn)A／BRCA途徑基因存在突變、缺失、甲基化修飾等的腫瘤細(xì)胞株對DDP等交聯(lián)劑類化療藥物有較高敏感性，應(yīng)用基因?qū)?、去甲基化等技術(shù)處理恢復(fù)相關(guān)基因功能后，細(xì)胞株FANCD2單泛素化水平升高或恢復(fù)，對DDP敏感性下降，表現(xiàn)為經(jīng)DDP處理后細(xì)胞存活率升高、凋亡下降、細(xì)胞S／G2周期阻滯效應(yīng)減弱等［6，15－18］，進(jìn)一步證實了FA／BRCA途徑在腫瘤細(xì)胞DDP耐藥機制中的重要作用。這也從另一方面提示，通過沉默F(xiàn)A／BRCA途徑某些基因的表達(dá)而抑制FA／BRCA途徑功能后，可以增加腫瘤細(xì)胞對DDP的敏感性。

正常細(xì)胞的FA／BRCA途徑基因缺損可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，DNA修復(fù)功能缺損，基因突變多發(fā)及增加腫瘤的易感性。而腫瘤細(xì)胞FA／BRCA途徑抑制則可增加腫瘤對交聯(lián)劑類化療藥物的敏感性，提高化療效果，為腫瘤的個體化治療提供新方案［19］。

本實驗結(jié)果顯示，A549／DDP細(xì)胞對DDP的敏感性明顯低于A549細(xì)胞，但FANCD2蛋白表達(dá)水平和FANCD2單泛素化水平，以及FANCD2核聚小體形成均明顯高于A549細(xì)胞，提示A549／DDP細(xì)胞對DDP敏感性下降的原因一定程度上是FA／BRCA途徑修復(fù)DNA損傷的功能強于A549細(xì)胞。應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默A549和A549／DDP細(xì)胞的FA／BRCA途徑關(guān)鍵基因FANCD2后，這兩種肺癌細(xì)胞株的IC50均顯著降低，F(xiàn)ANCD2蛋白表達(dá)及單泛素化水平均降低，對DDP敏感性均顯著提高，表明FA／BRCA途徑參與A549／DDP細(xì)胞株對DDP耐藥，應(yīng)用siRNA技術(shù)抑制FA／BRCA途徑FANCD2基因至少可部分逆轉(zhuǎn)其對DDP的耐藥性。

綜上所述，F(xiàn)A／BRCA途徑激活和高表達(dá)是肺癌細(xì)胞對DDP耐藥的重要分子生物學(xué)基礎(chǔ)，抑制此途徑FANCD2基因表達(dá)，可以部分逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對DDP的耐藥性。這些研究結(jié)果將可能為今后在臨床上通過檢測腫瘤細(xì)胞的FA／BRCA途徑基因表達(dá)，或應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)抑制FA／BRCA途徑功能，為化療肺癌患者制定個體化治療方案提供一定依據(jù)。

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Silence of FANCD2 gene of FA／BRCA pathway reverse the resistance to cisplatin in lung cancer A549／DDP cell line

JIANG He-guo1，DAIChun-hua1，LIJian1，CHEN Yong-chang2，LAN Ting2，WU Min2
（1.Department of Pulmonary Medicine，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Institute of Basal Medicine Science，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the effect of FANCD2 gene silence on the resistance to cisplatin（DDP）in lung adenocarcinoma A549／DDP cell line.M ethods：FANCD2 genes of A549／DDP cells were silenced by transfection of the designed and synthesized siRNA targeted FANCD2（FANCD2-siRNA）through Lipofectamine.CCK-8 techniquewas used tomeasure the cell proliferation rate of A549 and A549／DDP cells treated with DDP before and after siRNA transfection.Western blotting was carried out to detect the expression ofmonoubiquitination（L）and non-monoubiquitination（S）FANCD2 protein and L／S ratio before and after siRNA transfection.Immunofluorescence assay was performed to determine the formation of FANCD2 nuclear foci.Results：The cell proliferation rate and the levels of FANCD2 monoubiquitination（L／S ratio）weremarkedly higher in A549／DDP cells than in A549 cells treated with DDP（P＜0.05）.After transfection of FANCD2-siRNA，the levels of FANCD2 monoubiquitination，nuclear foci formation of FANCD2，and the cell proliferation ratewere significantly decreased in A549 and A549／DDP cells following DDP treatment（P＜0.05）.Conclusion：Silence of FANCD2 gene inhibited the function of FA／BRCA pathway by decreasing the monoubiquitination level and nuclear focus formation of FANCD2，resulting in the decrease of cell proliferation，and partial reversion of chemoresistance to cisplatin in lung cancer cell of DDP-resistance.

lung cancer cell；cisplatin；chemoresistance；FA／BRCA pathway；FANCD2；siRNA

姜賀果（1987—），男，碩士研究生；李堅（通訊作者），教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail：lijian541226＠163.com

R392.28；R979.1

A

1671－7783（2014）03－0201－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y140009

2014－01－07 ［編輯］劉星星