QuEChERS結(jié)合高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中的18種β－興奮劑

鄭 玲， 吳玉杰， 趙永鋒， 李麗華， 馬燕娟

(廣西出入境檢驗檢疫局，廣西南寧530021)

β-興奮劑(β-agonist)，俗稱瘦肉精，在化學(xué)上屬于苯乙胺類藥物，一般具有含苯乙醇胺的母體結(jié)構(gòu)。最早用于1988年，主要用于防治人、畜的支氣管哮喘和支氣管痙攣。這些藥物高劑量添加在飼料中，可以選擇性地作用于腎上腺素，導(dǎo)致動物體內(nèi)的脂肪分解代謝增強，增加蛋白質(zhì)的合成，顯著提高胴體瘦肉率。但如果長期食用含有大量β-興奮劑殘留的動物組織，會對人體健康造成很大傷害，包括中毒、引起惡性腫瘤，甚至致人死亡［1，2］等。農(nóng)業(yè)部于2002年2月發(fā)布的176號公告［3］《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》，其中就將克侖特羅、萊克多巴胺、西馬特羅等列為違禁藥物。之后，β-興奮劑類藥物一直是國家相關(guān)監(jiān)管部門的重點監(jiān)測項目之一。由于多年來對禁用藥物的嚴厲監(jiān)管，犯罪分子轉(zhuǎn)而添加同類替代藥物，比如:班布特羅、噴布特羅、苯乙醇胺A等。β-興奮劑的濫用嚴重威脅著人們的身體健康，農(nóng)業(yè)部于2010年12月再次發(fā)文(農(nóng)業(yè)部公告第1519號［4］)，禁止在飼料和動物飲水中使用班布特羅、齊帕特羅、氯丙那林、馬布特羅、阿福特羅、溴布特羅、噴布特羅、苯乙醇胺A等物質(zhì)。因此，建立多組分的同時測定方法，在實際監(jiān)督和執(zhí)法工作中對飼料進行實時監(jiān)測具有重要的意義。

QuEChERS 方法［5，6］利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用吸附雜質(zhì)，從而達到除雜、凈化的目的。因具有快速(quick)、簡單(easy)、廉價(cheap)、有效(effective)、可靠(rugged)和安全(safe)的特點而得名。此方法一經(jīng)問世就受到各國農(nóng)藥殘留分析者的普遍關(guān)注，發(fā)展十分迅速，現(xiàn)已成功地用于多種食品中多種農(nóng)藥殘留的分析［7-12］。QuEChERS方法很靈活，可根據(jù)分析物、基質(zhì)、儀器和分析者的偏好對凈化劑、鹽量、水含量和吸附劑等做改進，改進的方法也適用于含中等或高脂的食物。因此，近年來該技術(shù)也開始應(yīng)用于獸藥殘留檢測領(lǐng)域［13-15］。

有關(guān)β-興奮劑的分析測定方法涉及液相色譜法［16］、(氣相、液相)色譜-質(zhì)譜法［17-19］、酶聯(lián)免疫吸附法［20］等。實際工作中，多采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行確證，因為此法可以同時滿足高靈敏度、高選擇性的定性定量要求。但在已報道的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法中，前處理方法多為固相萃取方法，鮮有QuEChERS方法在飼料中β-興奮劑類違禁藥物檢測中的應(yīng)用報道。目前已發(fā)布的飼料中β-興奮劑類違禁藥物的國家標準［21，22］及報道的測定方法［23］使用的也是固相萃取法。本文建立了QuEChERS結(jié)合HPLC-MS/MS同時測定飼料中18種β-興奮劑的方法，為飼料中β-興奮劑類違禁藥物的監(jiān)控提供了又一個快速、有效的方法，有利于提升對β-興奮劑類違禁藥物的監(jiān)控水平。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:Agilent 1200 RRLC+Agilent 6410B質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI)(美國安捷倫科技有限公司);高速離心機:Sigma3-18k(德國Sigma公司);振蕩器:YAMATO SA300(日本Yamato Scientific Co.Ltd.);超純水器:Milli-Q Reference(美國Millipore公司)

克侖特羅(clenbuterol)、班布特羅(bambuterol)、馬布特羅(mabuterol)、克侖丙羅(clenproperol)等標準物質(zhì)純度均大于98%，噴布特羅(penbutolol)純度96%，萊克多巴胺(ractopamine)純度97%，購自 Dr.Ehrenstorfer GmbH;西馬特羅(cimaterol)、西布特羅(cimbuterol)、氯丙那林(clorprenaline)、溴布特羅(brombuterol)、馬賁特羅(mapenterol)、溴代克倫特羅(bromchlorbuterol)等純度均為99%，購自WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH;苯乙醇胺A(phenylethanolamine A)、妥布特羅(tulobuterol)、利托君(ritodrine)等純度均為98%，齊帕特羅(zilpaterol)純度95%，購自Toronto Research Chemicals Inc.;阿福特羅(arformoterol)純度99.9%，購自International Laboratory USA;苯氧丙酚胺(isoxsuprine)純度99.5%，購自U.S.Pharmacopeia。

C18、PSA 粉末(40 ～63 μm，CNW 公司);甲醇、乙腈、甲酸(色譜純);無水硫酸鈉、氯化鈉(分析純);水為Milli-Q超純水。

1.2 標準溶液的配制

稱取各標準品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，配成濃度為100 mg/L的標準儲備液，在-18℃保存。使用時根據(jù)需要用相應(yīng)的空白樣品基質(zhì)提取液配制適當濃度的標準工作液。

1.3 樣品處理

稱取樣品2 g(精確至0.01 g)，加水10 mL，渦旋30 s，超聲5 min。加入20 mL乙腈(含4%(v/v)氨水)、6 g無水硫酸鈉、2 g氯化鈉、渦旋混勻后振蕩20 min，于4 000 r/min下離心10 min，取2 mL上層清液于凈化管中(已加入25 mg C18和50 mg PSA)，渦旋2 min，于10 000 r/min下離心10 min，取1 mL凈化液于45℃氮氣吹干，1 mL流動相(甲醇-0.1%甲酸水溶液(1∶9，v/v))溶解，LCMS/MS測定。

1.4 HPLC-MS/MS 條件

1.4.1 HPLC 條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(50 mm×4.6 mm，1.8 μm)。流動相:A 為甲醇，B 為0.1%甲酸水溶液。梯度程序:0～1 min，10%A;1～3 min，10%A～40%A;3～5 min，40%A～70%A;5～7 min，70%A～90%A;7～10 min，90%A;10～11 min，90%A～10%A;11～15 min，10%A。流速:0.4 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:10 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源:ESI;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細管電壓:4 000 V;霧化氣溫度:350℃;霧化氣流速:12 L/min;霧化氣壓力:310.05 kPa(45 psi)。MRM監(jiān)測模式下的參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取試劑的優(yōu)化

應(yīng)用QuEChERS方法進行獸藥殘留測定時，乙腈或酸化乙腈是常用的提取溶劑。文獻［13］顯示，添加4%氨水的乙腈能提高β-興奮劑的提取率，因此，本實驗比較了乙腈、2%(v/v)氨水乙腈、4%(v/v)氨水乙腈、2%(v/v)乙酸乙腈、5%(v/v)乙酸乙腈的提取效果。結(jié)果顯示，用4%(v/v)氨水乙腈提取，90%的目標化合物回收率在85%～115%范圍內(nèi)，結(jié)果優(yōu)于其他的提取試劑。部分待測物，如克侖特羅、馬布特羅、溴代克侖特羅等，用以上幾種試劑提取，回收率無明顯差異;而西馬特羅、西布特羅、利托君等，在堿性條件下提取，回收率明顯高于中性及酸性條件。尤其是齊帕特羅，用4%氨水乙腈提取的回收率高于95%，而在中性和酸性條件下提取的回收率不足50%。原因可能是堿性條件能有效抑制這些化合物的離子化，從而增加其在有機相中的分配比例。因此本實驗選擇4%氨水乙腈為提取溶劑。

表1 18種分析物的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of the 18 analytes

2.2 凈化吸附劑的優(yōu)化

在QuEChERS凈化方法中，PSA、C18及石墨化炭黑(GCB)是常用的吸附劑。PSA可去除提取液中的脂類和糖類物質(zhì)，C18具有良好的除脂能力，GCB通常用于除去植物提取液中的色素成分，但對含苯環(huán)官能團的化合物有較強的吸附作用［16］。飼料中含有脂類、蛋白(在乙腈提取時已被沉淀)、糖類等干擾組分，而β-興奮劑類一般具有苯乙醇胺的母體結(jié)構(gòu)，故本研究只選取PSA和C18作為凈化吸附劑進行優(yōu)化。在同一加標濃度的樣品提取液中，分別加入6個不同組合的PSA和C18(1:25 mg C18;2:50 mg C18;3:75 mg C18;4:25 mg C18+50 mg PSA;5:25 mg C18+100 mg PSA;6:50 mg C18+50 mg PSA)吸附劑凈化，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，各待測物在采用組合4(C1825 mg+PSA 50 mg)凈化時有較好的回收率，90%的目標化合物回收率在90%～111%范圍內(nèi)。且實驗發(fā)現(xiàn)，僅使用C18(組合1、2、3)凈化時，樣品溶液顏色仍較深，吹干后剩余殘渣較多，進樣檢測后，離子源污染較嚴重。而組合4、5、6的凈化效果均較好。其中采用組合4、6凈化時，絕大部分待測物的回收率相當，但其中待測物噴布特羅在組合4的回收率明顯高于組合6。比較6個組合的回收率可以看出，PSA和C18使用量的增加都會引起噴布特羅的回收率下降，因此，選擇組合4(即25 mg C18+50 mg PSA)作為凈化劑。

圖1 不同凈化劑組合對18種待測物回收率的影響Fig.1 Effects of the usage amount of C18and PSA on recoveries of the 18 compounds

2.3 凈化方式及時間的選擇

凈化時采用的方式有兩種，渦旋或振蕩。實驗比較了渦旋1、2 min和振蕩5、10、20 min的凈化效果。結(jié)果顯示，不同振蕩時間對回收率和凈化效果無明顯影響，且與渦旋2 min的結(jié)果相當。而渦旋1 min的樣品，其響應(yīng)均有不同程度的降低，50%的待測物響應(yīng)降低20%以上。原因在于吸附時間過短，雜質(zhì)吸附不完全?？紤]到建立本實驗方法是為了快速前處理，且在實驗室也可實現(xiàn)批量樣品同時渦旋，因此選擇渦旋2 min為凈化條件。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評價及消除

基質(zhì)效應(yīng)是指由于基質(zhì)成分和目標化合物在電噴霧離子源進行離子化時相互競爭而導(dǎo)致目標化合物的信號強度有不同程度的增強或減弱。基質(zhì)效應(yīng)包括基質(zhì)增強效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。盡管樣品經(jīng)過乙腈沉淀蛋白、分散固相萃取后取得了良好的凈化效果，但仍無法完全消除基質(zhì)效應(yīng)，而基質(zhì)效應(yīng)的存在會對測定結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響。因此，在建立LC-MS/MS檢測方法時應(yīng)對基質(zhì)效應(yīng)進行評價，并采取措施進行消除，以保證結(jié)果的準確可靠。基質(zhì)效應(yīng)可采用(基質(zhì)匹配標準溶液所做曲線的斜率/無基質(zhì)標準溶液所做曲線的斜率-1)×100%進行評價［24］，負值表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，正值表示存在基質(zhì)增強效應(yīng)，絕對值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強。本實驗對18種待測物的基質(zhì)效應(yīng)進行了評價(見表2)，可以看出，萊克多巴胺的測定基本不受基質(zhì)影響，基質(zhì)對班布特羅的測定有增強效應(yīng)，其余化合物均存在一定的抑制效應(yīng)。其中，除氯丙那林和妥布特羅的抑制效應(yīng)大于25%外，其余化合物的抑制效應(yīng)均小于15%。這也可在一定程度上說明本實驗所建立的凈化方法具有較好的凈化效果。

可使用同位素內(nèi)標［25，26］(理化性質(zhì)與目標物幾乎一致)或配制基質(zhì)匹配標準溶液(為標準溶液提供與樣品溶液相似的離子化環(huán)境)的方法消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。同位素內(nèi)標一般都很昂貴，且已經(jīng)商品化的同位素內(nèi)標種類也非常有限，在已報道的使用 LC-MS/MS 的多組分殘留測定方法［14，15］中，大多采用基質(zhì)匹配標準溶液進行定量。本方法采用配制基質(zhì)匹配標準溶液的方法很好地消除了基質(zhì)影響，完全能滿足測定的要求。

表2 18種化合物的基質(zhì)效應(yīng)評價Table 2 Evaluation of matrix effects of the 18 compounds

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化與質(zhì)譜定性

根據(jù)待測物的性質(zhì)，分別配制1 mg/L的各種標準溶液，在ESI正離子模式下分別進行質(zhì)譜條件優(yōu)化。第一步進行母離子掃描，確定母離子，并優(yōu)化得到源內(nèi)碎裂電壓，然后在選定的源內(nèi)碎裂電壓條件下，對選定的母離子進行子離子掃描，選取豐度相對最強的子離子為定量離子，其次為定性離子，并分別對子離子的碰撞能進行優(yōu)化。最后，在MRM模式下優(yōu)化了霧化氣溫度、霧化氣流速及壓力。優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1及1.4.2節(jié)。

2.6 線性范圍、檢出限、定量限、回收率與精密度

用空白樣品基質(zhì)提取液配制 5、10、20、50、100、200 μg/L的系列混合標準溶液，在優(yōu)化的實驗條件下分離檢測，以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，以峰面積(y)為縱坐標作標準曲線，得各目標化合物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r2)(見表3)。結(jié)果顯示，18種待測物的r2為0.991 2～0.999 5，表明各目標化合物在5～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

在陰性飼料樣品中添加不同濃度的待測物，按本研究建立的方法進行檢測，以信噪比≥10確定各化合物的定量限均為0.05 mg/kg，以信噪比≥3確定各化合物的檢出限均為0.015 mg/kg。陰性飼料樣品添加0.05 mg/kg待測物的譜圖略。

取陰性飼料樣品，分別添加3個濃度水平的18種待測化合物，每個水平測定6份平行樣品，考察方法的回收率和精密度。結(jié)果見表4?？梢钥闯?，各化合物在3個加標水平的平均回收率為78.4%～107.1%，相對標準偏差(RSD)為3.5% ～12.3%。將該方法用于豬配合飼料、雞預(yù)混料、雞濃縮料等不同飼料樣品的檢測，加標回收率結(jié)果均一致。

表3 各化合物的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Regression equations and correlation coefficients(r2)of the 18 compounds

表4 陰性飼料樣品中18種β-興奮劑的加標回收率與相對標準偏差(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of the 18 β-agonists spiked in a blank sample(n=6)

2.7 實際樣品測定

應(yīng)用本研究建立的方法對30個不同廠家的雞、豬飼料樣品進行了18種β-興奮劑的檢測，結(jié)果表明，所有飼料樣品中均未發(fā)現(xiàn)這18種β-興奮劑。

3 結(jié)論

本文將QuEChERS前處理方法應(yīng)用于飼料中18種β-興奮劑的檢測，通過對QuEChERS前處理方法及儀器條件進行優(yōu)化，建立了定性、定量測定飼料中18種β-興奮劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法操作簡便，靈敏度高，對飼料基質(zhì)凈化效果好，可用于飼料中多種β-興奮劑類藥物的快速篩查和確證。

［1］ Guo W，Yang L J，Shi W C，et al.Chinese Journal of Analysis Laboratory(郭偉，楊麗君，時文春，等.分析試驗室)，2010，29(4):92

［2］ Teng N Y，Liu X H，He S H，et al.Chinese Journal of Health Laboratory Technology(滕南雁，劉向紅，何頌華，等.中國衛(wèi)生檢驗雜志)，2011，21(7):1617

［3］ Ministry of Agriculture.No.176 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China(農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第176號).［2002-02-09］.http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/201104/t20110422_1976307.htm

［4］ Ministry of Agriculture.No.1519 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China(農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1519號).［2010-12-27］.http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/201104/t20110422_1976294.htm

［5］ Liu X G，Xu J，Dong F S，et al.Anal Bioanal Chem，2011，401(3):1051

［6］ Wang J，Chow W，Cheung W.J Agric Food Chem，2011，59:8589

［7］ Xu J，Chen J，Ye H Y，et al.Journal of Instrumental Analysis(徐娟，陳捷，葉弘毅，等.分析測試學(xué)報)，2011，30(9):990

［8］ Xu J，Chen J，Wang L，et al.Journal of Instrumental Analysis(徐娟，陳捷，王嵐，等.分析測試學(xué)報)，2013，32(3):293

［9］ Zhang Z Y，Gong Y，Shan W L，et al.Chinese Journal of Chromatography(張志勇，龔勇，單煒力，等.色譜)，2012，30(1):91

［10］ Wang L Z，Zhou Y，Chen Y，et al.Chinese Journal of Chromatography(王連珠，周昱，陳泳，等.色譜)，2012，30(2):146

［11］ Sung W L，Jeong H C，Soon K C，et al.J Chromatogr A，2011，1218:4366

［12］ Ondrej L，Jana U，Jan P，et al.J Chromatogr A，2010，1217:648

［13］ Lan F，Zhang Y，Yue Z F，et al.Journal of Instrumental Analysis(藍方，張毅，岳振峰，等.分析測試學(xué)報)，2012，31(12):1471

［14］ Luo H T，Huang X L，Wu H Q，et al.Journal of Instrumental Analysis(羅輝泰，黃曉蘭，吳惠勤，等.分析測試學(xué)報)，2011，30(12):1329

［15］ Bu M N，Shi Z H，Kang J，et al.Journal of Instrumental Analysis(卜明楠，石志紅，康健，等.分析測試學(xué)報)，2012，31(5):552

［16］ Wang L，Li Y Q，Zhou Y K.Chinese Journal of Analysis Laboratory(王煉，黎源倩，周運柯.分析試驗室)，2009，28(3):78

［17］ Wang P L，F(xiàn)an L，Su X O，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(王培龍，范理，蘇曉鷗，等.分析化學(xué))，2012，40(3):470

［18］ Lu Y F，Xu L J，Wang H，et al.Journal of Chinese Mass Spectrometry Society(盧艷芬，徐麗君，王輝，等.質(zhì)譜學(xué)報)，2012，33(5):280

［19］ Cai Q R，Wu J S，Qian Z J，et al.Chinese Journal of Chromatography(蔡勤仁，吳潔珊，錢振杰，等.色譜)，2013，31(3):200

［20］ Wan Y P，Liu N，Tao G C，et al.Journal of Henan Agricultural Science(萬宇平，劉寧，陶光燦，等.河南農(nóng)業(yè)科學(xué))，2013，42(2):132

［21］ No.1029-1-2011 Bulletin of the Ministry of Agriculture，National Standards of the People’s Republic of China(農(nóng)業(yè)部1029號公告-1-2011，中華人民共和國國家標準)

［22］ No.1486-1-2010 Bulletin of the Ministry of Agriculture，National Standards of the People’s Republic of China(農(nóng)業(yè)部1486號公告-1-2010，中華人民共和國國家標準)

［23］ Li D N，Yan F，Zhang W G，et al.Feed Research(李丹妮，嚴鳳，張文剛，等.飼料研究)，2011(12):43

［24］ Tso J，Aga D S.J Chromatogr A，2010，1217:4784

［25］ Liu Y T，Ai X H，Yang H.Journal of Instrumental Analysis(劉永濤，艾曉輝，楊紅.分析測試學(xué)報)，2011，30(6):640

［26］ Zheng L，Wu Y J，Li Y，et al.Chinese Journal of Chromatography(鄭玲，吳玉杰，李湧，等.色譜)，2012，30(7):660