烏司他丁對甘油誘導(dǎo)橫紋肌溶解大鼠IL-6、TNF-α釋放的影響及其對橫紋肌的保護(hù)作用

潘志國，邵玉，陳懌，陳鏡合，蘇磊

烏司他丁對甘油誘導(dǎo)橫紋肌溶解大鼠IL-6、TNF-α釋放的影響及其對橫紋肌的保護(hù)作用

潘志國，邵玉，陳懌，陳鏡合，蘇磊

目的研究烏司他丁對甘油誘導(dǎo)橫紋肌溶解大鼠血漿白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響及其對橫紋肌的保護(hù)作用。方法24只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。正常對照組；模型組：肌注50%甘油8m l/kg；低劑量烏司他丁組和高劑量烏司他丁組：造模后分別靜脈給予1000U和5000U烏司他丁，1次/12h。72h后立即行下腔靜脈采血檢測大鼠血漿IL-6、TNF-α水平，并分離大鼠右后肢橫紋肌行病理及電鏡切片檢查。結(jié)果造模后大鼠血漿IL-6、TNF-α水平均較正常對照組明顯升高(P＜0.05)。低劑量烏司他丁組血IL-6、TNF-α水平分別為528.97±77.34、584.65±53.22pg/m l，高劑量烏司他丁組分別為860.68±45.32、480.45±49.78pg/m l，與正常對照組(分別為1546.14±106.33、414.52±55.19pg/m l)及模型組(分別為1994.09±99.45、822.93±78.23pg/m l)比較均明顯下降(P＜0.05)。病理切片及電鏡觀察結(jié)果顯示，烏司他丁組橫紋肌組織損傷較模型組明顯減輕，其中高劑量烏司他丁組橫紋肌肌紋基本恢復(fù)正常。結(jié)論烏司他丁可抑制甘油誘導(dǎo)橫紋肌溶解大鼠血漿IL-6和TNF-α的釋放，并對機(jī)體橫紋肌具有保護(hù)作用。

烏司他??；橫紋肌溶解；炎癥

橫紋肌溶解綜合征(rhabdomyolysis，RM)是指由一系列原因引起橫紋肌細(xì)胞膜損傷進(jìn)而造成細(xì)胞膜完整性改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)毒性物質(zhì)釋放入全身血液循環(huán)的綜合征[1]。近年來，隨著全球自然災(zāi)害(高溫、地震、海嘯等)以及降脂藥物、小龍蝦事件的頻繁發(fā)生[2-4]，橫紋肌溶解再次成為災(zāi)害醫(yī)學(xué)、重癥醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，橫紋肌溶解會解釋放出大量毒性物質(zhì)及細(xì)胞因子、自由基入血，誘發(fā)膿毒癥，二者相互促進(jìn)[1,5]。本研究根據(jù)Yousefipour等[6]的方法應(yīng)用甘油誘導(dǎo)Wista大鼠橫紋肌溶解模型，觀察大鼠血中IL-6、TNF-α的表達(dá)以及橫紋肌的病理變化，探討烏司他丁對橫紋肌溶解大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 24只雄性W ista大鼠(SCXK2011-0015)，體重300±20g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。50%超純甘油購自美國Am resco公司，ELISA檢測試劑盒為韓國KOMA公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純，烏司他丁購自廣州天普公司。

1.2 建模及分組 所有動物單籠飼養(yǎng)，第1天禁水不禁食，第2天以50%(V/V)甘油8m l/kg右側(cè)后肢肌內(nèi)注射，注射甘油后飲水、飲食不限。24只大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。正常對照組；模型組：肌內(nèi)注射50%甘油8m l/kg造模，造模成功后大鼠肌內(nèi)病理切片呈橫紋肌溶解表現(xiàn)；低劑量烏司他丁組：造模后每只大鼠靜脈注射1000U烏司他丁，1次/12h；高劑量烏司他丁組：造模后每只大鼠靜脈注射5000U烏司他丁，1次/12h。72h后立即行下腔靜脈采血并分離大鼠右后肢橫紋肌。

1.3 大鼠血IL-6、TNF-α水平檢測 各組大鼠采用10%水合氯醛(3m l/kg)腹腔注射麻醉，打開腹腔、胸腔，快速心臟采血5m l，立即置于干燥管內(nèi)，輕緩混勻后，3000r/m in離心10m in，取血清–20℃低溫保存待測。采用ELISA法檢測大鼠血清IL-6、TNF-α水平。

1.4 病理及電鏡觀察 大鼠采血后迅速分離右后肢橫紋肌，用生理鹽水沖洗干凈后，一部分投入4%多聚甲醛液中固定24h，送廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院病理科行病理檢查(HE染色)。另一部分切成1mm3小塊組織，移入裝有前固定液的標(biāo)本瓶內(nèi)，置4℃冰箱固定3～4h后送廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科進(jìn)行電鏡室檢查。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組資料之間的比較采用單因素方差分析，在方差齊性基礎(chǔ)上的兩兩比較采用SNK-t法，P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 烏司他丁對甘油損傷大鼠血漿IL-6、TNF-α釋放的抑制作用 造模后大鼠血漿IL-6、TNF-α水平均較正常對照組明顯升高(P＜0.05)。靜脈給予烏司他丁后，低劑量及高劑量烏司他丁組大鼠血漿IL-6、TNF-α水平均有所下降(表1)。

表1 各組大鼠血清IL-6、TNF-α檢測結(jié)果(pg/m l，±s，n=6)Tab.1 Serum IL-6 and TNF-α levels of rats in each group(pg/ m l,±s, n=6)

表1 各組大鼠血清IL-6、TNF-α檢測結(jié)果(pg/m l，±s，n=6)Tab.1 Serum IL-6 and TNF-α levels of rats in each group(pg/ m l,±s, n=6)

(1)P＜0.05 com pared w ith normal control group; (2)P＜0.05 compared with model group

Group IL-6 TNF-α Normal control group 1546.14±106.33 414.52±55.19 Model group 1994.09±99.45(1)822.93±78.23(1)Low-dose ulinastatin group 528.97±77.34(2)584.65±53.22(2)High-dose ulinastatin group 860.68±45.32(2)480.45±49.78(2)

2.2 橫紋肌病理切片結(jié)果 光鏡下觀察，正常對照組大鼠橫紋肌肌紋正常；模型組出現(xiàn)肌肉溶解，組織細(xì)胞吞噬細(xì)胞碎屑的現(xiàn)象；應(yīng)用烏司他丁后，肌肉溶解損傷明顯減少，在高劑量烏司他丁組，橫紋肌肌紋甚至基本正常(圖1)。

2.3 電鏡下觀察橫紋肌改變 高倍電鏡下觀察可見，正常對照組大鼠肌組織Z線排列整齊，肌節(jié)正常，無肌溶解灶出現(xiàn)。模型組部分橫紋肌肌纖維和Z線消失，明顯肌溶灶；低劑量烏司他丁組橫紋肌組織Z線排列整齊，肌節(jié)正常，僅見部分切片少量肌溶解灶出現(xiàn)及部分Z線增粗，肌纖維減少；高劑量烏司他丁組橫紋肌組織Z線排列整齊，肌節(jié)正常，僅見少量肌溶解灶出現(xiàn)(圖2)。

圖1 各組大鼠橫紋肌組織病理學(xué)觀察(HE ×100)Fig.1 Histopathological observation of rats' rhabdomyolysis in each group (HE ×100) A.Normal control group; B.Model group; C.Low-dose ulinastatin group; D.High-dose ulinastatin group.Arrows show the dissolving muscle

圖2 電鏡觀察各組大鼠橫紋肌溶解情況Fig.2 The rhabdomyolysis in different groups (Electronic m icroscopy) A.Normal control group; B.Model group; C.Low-dose ulinastatin group; D.High-dose ulinastatin group.Arrows show the striated muscle

3 討 論

橫紋肌溶解是由于骨骼肌細(xì)胞破壞，釋放胞內(nèi)容物入血，導(dǎo)致多臟器功能損害的綜合征。除自身遺傳性疾病外，創(chuàng)傷、高強(qiáng)度訓(xùn)練、局部缺血、藥物、毒素、代謝疾病、感染等均可導(dǎo)致橫紋肌溶解[7-9]。橫紋肌溶解的基本原因包括線粒體Ca離子超載-線粒體功能障礙；磷脂酶A2活化；橫紋肌細(xì)胞持久收縮；自由基產(chǎn)生-氧化性應(yīng)激[3]；細(xì)胞凋亡等。釋放至胞外的毒性物質(zhì)可導(dǎo)致肌細(xì)胞鄰近微血管發(fā)生損傷，加劇局部能量耗竭。同時(shí)，損壞的微血管內(nèi)皮細(xì)胞裸露，導(dǎo)致循環(huán)中白細(xì)胞附著而活化，繼而釋放氧自由基及蛋白水解酶類[2]。橫紋肌溶解還可通過多種原因?qū)е麓罅堪麅?nèi)毒素及自由基等物質(zhì)釋放入血循環(huán)、凝血功能紊亂、血管內(nèi)皮損傷、酸堿失衡等多種因素誘發(fā)膿毒癥，造成多器官功能衰竭，從而增加患者死亡率[10]。

烏司他丁是人體內(nèi)的一種天然酶抑制劑，可從健康男性尿液中分離純化獲得，其藥理作用包括穩(wěn)定溶酶體膜，抑制水解酶活性，抗炎、抗休克及抗缺血，抑制促炎細(xì)胞素TNF-α和IL-6的釋放，抑制氧自由基產(chǎn)生，提高機(jī)體對氧自由基清除能力，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度等[11-14]。因?yàn)樵撍帉σ种迫磉^度炎癥反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受炎癥侵害具有重要意義，在臨床上廣泛應(yīng)用于全身炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒癥、重癥肺炎、重癥胰腺炎、凝血功能紊亂等疾病的治療[15-17]。

在本實(shí)驗(yàn)中，給予烏司他丁后，甘油誘導(dǎo)造成的橫紋肌溶解大鼠的IL-6和TNF-α水平均明顯降低(P＜0.05)，提示烏司他丁對甘油誘導(dǎo)橫紋肌溶解大鼠機(jī)體促炎細(xì)胞素TNF-α和IL-6的釋放具有明顯的抑制作用。由病理切片可以看出，低劑量烏司他丁組橫紋肌組織雖然仍有小部分橫紋消失，但較使用前明顯好轉(zhuǎn)。從電鏡圖片來看，應(yīng)用烏司他丁后橫紋肌Z線排列整齊，肌節(jié)正常，僅小部分Z線增粗，肌纖維減少。

綜上所述，應(yīng)用烏司他丁后大鼠橫紋肌組織溶解情況明顯好轉(zhuǎn)，表明烏司他丁可抑制甘油誘導(dǎo)橫紋肌溶解大鼠IL-6和TNF-α的釋放，并對機(jī)體橫紋肌具有保護(hù)作用。烏司他丁作為抗炎藥物對于橫紋肌溶解的保護(hù)作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

[1] Pan ZG, Su L, M eng FS, et al.The pathophysio logy o f rhabdomyolysis and the relationship w ith sepsis[J].Lingnan J Emerg Med, 2008, 13(5): 398-399, 402.[潘志國, 蘇磊, 孟繁甦.橫紋肌溶解癥病理生理及其與膿毒癥關(guān)系[J].嶺南急診醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 13(5): 398-399, 402.]

[2] Xie GX, Guo BF, Chen Y, et al.The ep idem io logy o f rhabdomyolysis induced by crayfish intake[J].Mod Prev Med, 2012(20): 5239-5240.[謝國祥, 郭寶福, 陳洋, 等.食用小龍蝦致橫紋肌溶解綜合征事件的流行病學(xué)調(diào)查[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2012(20): 5239-5240.]

[3] Xu H.1 cases of rhabdomyolysis induced by rosuvstatin[J].J Clin Rational drug, 2013, 6(2): 71.[徐虹.瑞舒伐他汀致橫紋肌溶解癥1例[J].臨床合理用藥雜志, 2013, 6(2): 71.]

[4] Yue H J, Song XJ, Leng J, et al.Rhabdomyolysis induced by rosuvstatin[J].Adverse Drug React J, 2011, 13(6): 389-390.[岳慧杰, 宋小駿, 冷靜, 等.瑞舒伐他汀致橫紋肌溶解癥[J].藥物不良反應(yīng)雜志, 2011, 13(6): 389-390.]

[5] de Meijer AR, Fikkers BG, de Keijzer MH, et al.Serum creatine kinase as predictor of clinical course in rhabdomyolysis: a 5-year intensive care survey[J].Intensive Care Med, 2003, 29(7): 1121-1125.

[6] Yousefipour Z, Hercule H, Oyekan AO, et al.Antioxidant U74389G improves glycerol-induced acute renal failure without affecting PPARgamma gene[J].Ren Fail, 2007, 29(7): 903-910.

[7] Guis S, Mattei JP, Cozzone PJ, et al.Pathophysiology and clinical presentations of rhabdomyolysis[J].Joint Bone Spine, 2005, 72(5): 382-391.

[8] Zhou CH, Li M, Yu YW, et al.High-intense m ilitary training resulting in renal impairment in navy army[J].Med J Chin PLA, 2008, 33(12): 1488-1490.[周春華, 李猛, 余永武, 等.海軍部隊(duì)高強(qiáng)度軍事訓(xùn)練致腎臟損傷的調(diào)查分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 33(12): 1488-1490.]

[9] Su L.The prevention and treatment in severe heat stroke[J].Med J Chin PLA, 2011(9): 883-885.[蘇磊.重癥中暑防治回顧與啟示[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志.2011(9): 883-885.]

[10] M a PL, Su JW, Wang Y, et al.C linical studies o f MODS secondary to rhabdomyolysis[J].Med J Chin PLA, 2006, 31(10): 1021-1023.[馬朋林, 蘇瑾文, 王宇, 等.橫紋肌溶解繼發(fā)爆發(fā)型多器官功能衰竭的臨床研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 31(10): 1021-1023.]

[11] Cao WY, Jin FG, Luo Y, et al.The effect of ulinastatin in rats with ALI induced by sea water drowning[J].Chin J Respir Crit Care Med, 2011, 10(2): 139-143.[曹萬英, 金發(fā)光, 羅穎, 等.烏司他丁治療大鼠海水淹溺型急性肺損傷的實(shí)驗(yàn)觀察[J].中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志, 2011, 10(2): 139-143.]

[12] Ni HY, Fang Q, Zhang YT, et al.The effect of ulinastatin on the inflammation and its therapeutic effect in patients with severe sepsis[J].Chin Emerg Med, 2008, 28(4): 342-344.[倪紅英, 方強(qiáng), 章云濤, 等.烏司他丁對重癥膿毒癥患者炎性反應(yīng)的影響及療效評價(jià)[J].中國急救醫(yī)學(xué), 2008, 28(4): 342-344.]

[13] Xu T, Li W, Lu PY, et al.The therapeutic effect and safety of ulinastatin on the treatment of patients with moderate and severe burning[J].Chin Clin Med, 2006, 13(5): 863-864.[許濤, 李衛(wèi),陸平言, 等.烏司他丁治療中重度燒傷患者的療效與安全性評價(jià)[J].中國臨床醫(yī)學(xué), 2006, 13(5): 863-864.]

[14] Xie K, Huang YS, Zhou JL, et al.The cardiac p rotection o f ulinastatin on the treatment of rats with severe burning[J].J Third M il Med Univ, 2005, 27(12): 1244-1246.[謝康, 黃躍生,周軍利, 等.烏司他丁對嚴(yán)重燙傷大鼠早期心肌損害保護(hù)作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).2005, 27(12): 1244-1246.]

[15] Jiang JJ, Shi XY, Yuan HB, et al.The effect of ulinastatin on the pulmonary NF-κB expression in rats with ALI[J].Med J Chin PLA, 2009, 34(5): 550-553.[蔣京京, 石學(xué)銀, 袁紅斌, 等.烏司他丁對急性肺損傷大鼠肺組織NF-κB表達(dá)的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 34(5): 550-553.]

[16] Xu Z, Wang ZQ, Liu XZ, et al.The effect of ulinastatin on the human coagulation function in vitro[J].Med J Chin PLA, 2009, 34(12): 1445-1447.[徐震, 王卓強(qiáng), 劉秀珍, 等.烏司他丁對人凝血功能影響的體外觀察[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 34(12): 1445-1447.]

[17] Su L, Zhou DY, Tang YQ, et al.The rationality of ulinastatin and thymopeptidesα1 on the immuno-regulation in patients with sepsis[J].Med J Chin PLA, 2007, 32(2): 161-163.[蘇磊, 周殿元, 唐柚青, 等.烏司他丁聯(lián)合胸腺肽α1對膿毒癥患者免疫調(diào)理的合理性分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 32(2): 161-163.]

Effect of ulinastatin on the release of IL-6 and TNF-α in rats with rhabdomyolysis induced byglycerol and its protective effect on striated muscle

PAN Zhi-guo1, SHAO Yu2, CHEN Yi1, CHEN Jing-he3, SU Lei1*1Department of ICU, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Command, The Military Key Laboratory of Trauma Care and Tissue Repair in Hot Zone of PLA,2Department of Overseas Chinese, Guangzhou 510010, China
3Department of Medicine, First Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China
*

, E-mail: slei_icu@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of ulinastatin on the levels of serum IL-6 and TNF-α in rats w ith rhabdomyolysis induced by glycerol, and its protective effect on striated muscle.MethodsTwenty-four rats were random ly divided into 4 groups (6 each): normal control group, model group with intramuscular injection of 8m l/kg glycerol, low-dose and high-dose treatment group with intravenous injection of 1000 and 5000U ulinastatin respectively, once per 12h.The rats were sacrificed 72h after treatment.The levels of serum IL-6 and TNF-α were determ ined, and pathological changes in striated muscle in the affected limb were exam ined under electron m icroscope.ResultsThe serum IL-6 and TNF-α levels were 528.97±77.34, 584.65±53.22 in low-dose treatment group, and 860.68±45.32, 480.45±49.78 in high-dose treatment group, which were significantly lower than those in normal control group (1546.14±106.33, 414.52±55.19 respectively) and in model group (1994.09±99.45, 822.93±78.23 respectively, P＜0.05).The pathological exam ination showed that the changes in striated muscle was milder in both treatment groups than in model group.ConclusionUlinastatin can inhibit the release of serum IL-6 and TNF-α and protect the striated muscle from impairment in rats w ith rhabdomyolysis induced by glycerol.

ulinastatin; rhabdomyolysis; inflammatory

R685.5

0577-7402(2014)02-0105-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2014.02.05

2013-11-08；

2014-01-04)

(責(zé)任編輯：熊曉然)

This work was supported by the Key Program of “Twelfth Five-year” Military Medicine Technology Research (BWS12J018), and the National Natural Science Foundation of China(81071529, 81101467, 81101406)

全軍醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究“十二五”發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS12J018)；國家自然科學(xué)基金(81071529、81101467、81101406)

潘志國，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師。主要從事急危重病科研及臨床救治

510010 廣州 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(潘志國、陳懌、蘇磊)，華僑科(邵玉)；510405 廣州 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)科(陳鏡合)

蘇磊，E-mail: slei_icu@163.com