基于PSS/PAH包被的AuNRs免疫傳感器用于CEA的測定*

牛小方， 趙錦航， 鄭麗， 楊云慧

(云南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500)

1 引 言

癌胚抗原(CEA)最初由Gold和Freedman在1965年首次發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌及胎兒腸組織中，其后的研究表明CEA是存在于細(xì)胞表面的富含多糖的蛋白復(fù)合物，相對分子量約為15 000～20 000[1].它是目前國際上公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物.在正常成人血清中含量甚微，而腫瘤患者的血清CEA水平會升高[2]，當(dāng)CEA濃度高于20 ng/mL時(shí)，則意味著可能患有消化道腫瘤.因此對CEA的研究對結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、胃癌等惡性腫瘤的鑒別診斷、病情檢測、臨床診斷和術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移檢測均具有重要的意義[3-6].

已有多種檢測方法用于血清中CEA的測定，包括酶聯(lián)免疫法(ELISA)[7-9]、電化學(xué)免疫傳感器(ECLIA)[10-11]、質(zhì)譜分析法(MS)[12-13]、熒光檢測法[14]、放射免疫測定法(RIA)[15-16].然而采用紫外可見分光光度法檢測CEA的報(bào)道并不多見.

目前由于納米技術(shù)的發(fā)展，各種各樣的金納米材料被應(yīng)用于生物及醫(yī)療領(lǐng)域，包括生物傳感器、藥物運(yùn)輸、光熱治療、醫(yī)學(xué)成像等[17-18]，這是因?yàn)樗鼈冇兄厥獾奈锢砗凸鈱W(xué)性質(zhì).由于金納米棒(AuNRs)是一種棒狀的金納米顆粒，特殊的形狀使其具有更為奇特的性質(zhì).其突出的光學(xué)性質(zhì)之一是有著縱向和橫向兩種表面等離子共振吸收峰，在可見光到近紅外光區(qū)的光有著較強(qiáng)的吸收和散射能力[19-21]，并且其制備方法簡單，有著良好的穩(wěn)定性質(zhì).通過自組裝，AuNRs很容易得到具有一維(1D)、二維(2D)、三維(3D)的有序結(jié)構(gòu)的自組裝體系，使其在生物分子的檢測、光學(xué)器件以及癌癥治療和檢測方面有著重要的潛在應(yīng)用[22].

本文將AuNRs的表面等離子共振現(xiàn)象和免疫分析技術(shù)相結(jié)合研究了一種新型的CEA免疫傳感器.由于在AuNRs合成過程中需要用十六烷基溴化銨(CTAB)作為金納米棒生長的保護(hù)劑和軟模板，而CTAB具有生物毒性[23-25]，所以必須去除其毒性效應(yīng).Wilson等發(fā)現(xiàn)利用聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)和聚丙烯氯化銨(PAH)之間的靜電吸附作用而層層堆積(LBL)在AuNRs表面，這樣可以覆蓋AuNRs的生物毒性[26].然后通過戊二醛使PAH與CEA抗體(Ab)相交聯(lián)，將Ab固定在AuNRs的表面，再用牛血清蛋白(BSA)封閉其表面未結(jié)合位點(diǎn)，以避免非特異性吸附作用.未加入CEA時(shí)，AuNRs在溶液中呈分散的狀態(tài)，當(dāng)加入CEA后，由于CEA與Ab發(fā)生特異性的作用，導(dǎo)致AuNRs發(fā)生自組裝，從而引起AuNRs的表面等離子共振吸收發(fā)生變化.通過測定其吸收峰的變化，實(shí)現(xiàn)CEA濃度的測量.該方法克服了AuNRs上面的CTAB對生物分子的毒性效應(yīng)，可用于CEA的定性和定量檢測.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

CTAB、硼氫化鈉(NaBH4)、硝酸銀(AgNO3)、抗壞血酸(AA)、戊二醛購于國藥集團(tuán)試劑有限公司(上海)；磷酸鹽緩沖溶液(10 mmol/L，PBS)、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)、聚丙烯氯化銨(PAH)、殼聚糖(CHIT)購于美國sigma公司；牛血清蛋白(BSA)、癌胚抗原(CEA)、CEA抗體(Ab)、氯金酸(HAuCl4)購于昆明鉑銳金屬材料有限公司；絲網(wǎng)印刷電極(TE100)購于臺灣禪普科技有限公司；實(shí)驗(yàn)室所用水為二次蒸餾水.

UV-1800紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；一次性絲網(wǎng)印刷電極(臺灣禪普科技有限公司)；JOEL JEM-2100透射電子顯微鏡；TGL 16型離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)；HY-2型多用振蕩器(國華電器有限公司)；CHI 660C電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器公司).

2.2 實(shí)驗(yàn)過程

2.2.1 AuNR合成

AuNR的合成方法是在CTAB溶液的環(huán)境中通過種子介導(dǎo)的方法合成，主要步驟如下：取40.5 μL HAuCl4(2.346×10-2mol/L)溶液加入到4.0 mL CTAB(0.1 mol/L)溶液中，充分?jǐn)嚢韬笕芤鹤優(yōu)闇\黃色.迅速注入24 μL NaBH4(0.1 mol/L)冰水混合物，繼續(xù)攪拌直到溶液由淺黃色變?yōu)樽厣?將溶液在28 ℃環(huán)境溫度下靜置2 h后得到種子溶液.取206 μL HAuCl4(2.346×10-2mol/L)和10 μL AgNO3(0.1 mol/L)于10 mL CTAB(0.1 mol/L)溶液中并攪拌.加入52.5 μL AA(0.1 mol/L)，繼續(xù)攪拌到溶液變?yōu)闊o色，向溶液中注入30 mol/L種子溶液，將其在28 ℃環(huán)境溫度下靜置3 h.將AuNRs在9 000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離，用二次蒸餾水洗滌后分散于蒸餾水中.最終得到長度約為40～50 nm，直徑約為10～15 nm并且表面帶有CTAB分子的AuNRs.

2.2.2 AuNRs的表面修飾過程

通過利用層層堆積(LBL)的作用，將AuNRs的表面氨基化，使其與Ab相互交聯(lián).修飾過程如下：取1 mL PSS(10 mg/mL)加入到5 mL AuNRs溶液中，在振蕩器上振搖30 min，使帶負(fù)電荷的PSS靜電吸附到帶正電的CTAB分子表面.然后加入1 mL 帶正電荷且含有氨基的聚電解質(zhì)PAH(10 mg/mL)，繼續(xù)搖振30 min，重復(fù)兩次.最后AuNRs表面被PSS和PAH層層堆積在一起.將1 mL戊二醛(5%)加入到AuNRs中混勻后靜置活化1 h，7 000 rpm離心分離，棄去上層清夜.用PBS洗滌三次，去除過量的戊二醛.將AuNRs分散在1 mL PBS中，加入100 μL Ab，室溫下振搖約12 h，在9 000 rpm下離心分離5 min，棄去上層清夜.加入500 μL 5%的BSA振搖30 min以封閉AuNRs表面的非特異性結(jié)合位點(diǎn).產(chǎn)物離心分離，用PBS洗滌以除去游離的Ab和BSA，最終得到表面帶有Ab的AuNRs.

2.2.3 實(shí)驗(yàn)原理及流程

當(dāng)向溶液中加入CEA后，其與Ab會發(fā)生特異性結(jié)合.由于Ab已經(jīng)被修飾在AuNRs的表面，而使AuNRs相互吸附發(fā)生自組裝現(xiàn)象，導(dǎo)致其紫外吸收峰的變化.隨著CEA濃度的增加，其與Ab的結(jié)合數(shù)量增多，發(fā)生自組裝的AuNRs也越多，紫外吸收峰變化的也越多.通過測量其長軸的吸收峰(840 nm附近)吸光度變化情況即可實(shí)現(xiàn)對CEA的定量測定.實(shí)驗(yàn)流程及原理如圖1.

圖1 免疫傳感器檢測CEA的原理示意圖

3 結(jié)果與討論

3.1 AuNRs在檢測CEA前后的形貌表征

在對CEA檢測的過程中，采用JEOL JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM)觀察AuNRs在加入CEA前后的對比.從圖2可以看出未加入CEA之前，AuNRs呈現(xiàn)良好的分散狀態(tài)，未發(fā)生自組裝(圖2A).當(dāng)加入CEA反應(yīng)后，AuNRs相互之間相互吸附并且堆疊在一起，發(fā)生自組裝現(xiàn)象(圖2B).

圖2 金納米棒溶液在加入CEA的前后變化的透射電鏡圖

3.2 AuNRs表面不同修飾界面的電化學(xué)行為

用殼聚糖溶液將AuNRs固定到絲網(wǎng)印刷電極上，通過電化學(xué)交流阻抗法和循環(huán)伏安法可以用來表征物質(zhì)在修飾過程中界面的變化情況[27].圖3為AuNRs在修飾過程中各界面在含有5 mmol/L K3Fe(CN)6、5 mmol/L K4Fe(CN)6和0.1 mol/L KCl混合溶液中的電化學(xué)交流阻抗曲線和對應(yīng)的循環(huán)伏安曲線.

圖3A中曲線a為未修飾過的AuNRs在電極上的電化學(xué)交流阻抗曲線，只有較小的電化學(xué)阻抗值；曲線b為修飾過PSS之后的AuNRs電化學(xué)交流阻抗曲線，其阻抗值增大，表明PSS已修飾到AuNRs表面，阻礙了電子的傳遞.曲線c為PSS/AuNRs表面被修飾PAH之后的電化學(xué)阻抗曲線，電阻進(jìn)一步增大，說明PAH已和PSS發(fā)生層層堆積現(xiàn)象；曲線d為PAH/PSS/AuNRs結(jié)合了抗體Ab之后的電化學(xué)行為，其電化學(xué)交流阻抗值最大，表明CEA抗體Ab已與PAH發(fā)生結(jié)合，并且固定到AuNRs表面.

圖3B中，曲線a為AuNRs在絲網(wǎng)印刷電極上的循環(huán)伏安曲線(CV曲線)，有一對可逆性較好的氧化還原峰，其氧化峰電流為27 μA；曲線b為PSS/AuNRs中CV曲線，此時(shí)仍然有較好的氧化還原峰，其氧化峰電流稍有降低，為12 μA；曲線c為PAH/PSS/AuNRs的CV曲線，其氧化峰電流進(jìn)一步減小到5 μA，這表明電極表面仍允許電活性探針鐵氰化鉀通過其孔道進(jìn)行擴(kuò)散傳質(zhì)；曲線d為Ab/PAH/PSS/AuNRs的CV曲線，此時(shí)氧化還原峰幾乎消失，表明CEA抗體Ab在AuNRs表面形成了穩(wěn)定的Ab/PAH/PSS/AuNRs復(fù)合物，妨礙了K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6的擴(kuò)散過程，AuNRs有了較強(qiáng)的特異性.

圖3 不同表面修飾過程的金納米棒在含有5 mmol/L K3Fe(CN)6、5 mmol/L K4Fe(CN)6和0.1 mol/L KCl 混合溶液中的電化學(xué)交流阻抗(A)和循環(huán)伏安曲線(B)

3.3 檢測條件的優(yōu)化

3.3.1 CEA與AuNRs的結(jié)合時(shí)間對紫外可見吸收強(qiáng)度的影響

Ab與CEA發(fā)生特異性結(jié)合的時(shí)間對AuNRs的自組裝的性能有著至關(guān)重要的作用，圖4表示CEA加入Ab/PAH-PSS/AuNRs溶液后，其紫外吸收峰強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線.由圖可以看出在0～60 min區(qū)間內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，其紫外吸收強(qiáng)度越來越小，在60～100 min區(qū)間，其紫外可見吸收強(qiáng)度變化很小，這表明在Ab與CEA結(jié)合時(shí)間為60 min時(shí)達(dá)到最佳結(jié)合狀態(tài)，AuNRs發(fā)生自組裝已達(dá)到穩(wěn)定，所以選擇60 min為CEA與Ab/PAH-PSS/AuNRs結(jié)合的最佳時(shí)間.

3.3.2 溶液的pH對CEA測定的影響

圖4 CEA與金納米棒的結(jié)合時(shí)間對紫外可見吸收強(qiáng)度的影響

Fig.4 Effect of the reaction time of CEA and AuNRs on Uv-Vis absorption intensity

考察溶液pH在6.8～8.0區(qū)間內(nèi)變化時(shí)對CEA檢測的影響(圖5).結(jié)果表明，在pH為7.6的時(shí)候，其檢測效果最好，所以選擇pH值為7.6的溶液環(huán)境作為CEA的測試溶液.

圖5 溶液pH對紫外可見吸收強(qiáng)度的影響

圖6 免疫傳感器檢測不同濃度CEA時(shí)的吸收光譜圖(A)和校正曲線(B)

3.4 傳感器對CEA的檢測性能

圖6為傳感器檢測不同濃度的CEA時(shí)的紫外吸收曲線和校正曲線，在10～100 ng/mL的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=2.102 6-0.013x(其中y為吸光度，x為CEA的濃度)，檢測下限為3.33 ng/mL.

3.5 抗干擾實(shí)驗(yàn)

在相同測試條件下，選擇幾種可能的干擾物質(zhì)，如甲胎蛋白(AFP)(40 ng/mL)、免疫球蛋白(IgG)(40 ng/mL)、人絨毛膜促性腺(HCG)激素(40 ng/mL)與CEA(40 ng/mL)做對比.圖7表示加入這些干擾物之后的AuNRs長軸吸收峰強(qiáng)度的變化值(Sensitivity)，從圖中可以看出該傳感器對CEA的響應(yīng)明顯大于其他物質(zhì)，說明該傳感器對CEA具有良好的選擇性.

圖7 免疫傳感器對幾種可能干擾的物質(zhì)的選擇性

3.6 回收率的測定

對傳感器進(jìn)行CEA回收率的測定，將血清樣品用PBS溶液稀釋，測定結(jié)果如表1所示.其平均回收率為94.55%，說明該傳感器可用于實(shí)際樣品中CEA的測定.

表1 CEA回收率的測定

4 結(jié) 論

利用種子介導(dǎo)的方法合成了AuNRs，并且利用聚電解質(zhì)聚合物PSS和PAH將AuNRs表面具有生物毒性的CTAB所覆蓋，使AuNRs表面成功固定了CEA抗體，研制了一種新型的基于AuNRs的免疫傳感器，該傳感器檢測速度快，具有良好的檢測范圍，并且可以將該檢測方法推廣到其他的生物分子檢測，為抗癌物質(zhì)的檢測提供一種較好的新方法.

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