高效液相色譜法測定鹽酸阿考替胺三水合物工業(yè)品含量

周圩群，喬俊琴，練鴻振*

(1.南通市廣播電視大學(xué)，江蘇 南通 226006；

2.生命分析國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院和現(xiàn)代分析中心，江蘇 南京 210093)

鹽酸阿考替胺是由日本Zeria公司研制的一種新型Ml、M2受體拮抗劑，臨床上用于提高胃的蠕動，以治療功能性消化不良[1]，2013年2月在日本批準(zhǔn)上市。與一般促胃腸動力藥(伊托必利、莫沙比利)不同，鹽酸阿考替胺能夠通過促進(jìn)腸內(nèi)膽堿神經(jīng)末梢乙酰膽堿的釋放來提高胃腸蠕動[2-8]，為第一個胃腸蠕動改善藥物。鹽酸阿考替胺三水合物的化學(xué)名為N-{2-[1-甲基乙基]乙基}-2-[(2-羥基-4,5-二甲氧基苯甲?；?氨基]噻唑-4-甲酰胺鹽酸鹽三水合物(結(jié)構(gòu)圖見圖1)。目前，促胃動力藥占消化道用藥的市場份額呈現(xiàn)出快速增長的趨勢，因此，鹽酸阿考替胺三水合物有著巨大的市場前景。本世紀(jì)初，國外已有鹽酸阿考替胺水合物合成方法的報道[9]。近年來，國內(nèi)外相繼出現(xiàn)多個關(guān)于鹽酸阿考替胺以及鹽酸阿考替胺三水合物合成方法的專利[10-15]。對于一個產(chǎn)品，分析測試不僅可以對產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)，還對產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)起著重要的指導(dǎo)作用[16]，然而對鹽酸阿考替胺三水合物分析方法的公開報道甚少，目前只有Furuta等[17]報道了用固相萃取提取狗血中鹽酸阿考替胺三水合物，以甲醇-磷酸二氫鉀-辛烷磺酸鈉為流動相采用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行測定的方法。該方法使用的離子對試劑辛烷磺酸鈉，在流動相中使用時，系統(tǒng)前平衡和后沖洗均需較長時間，因而整個分析過程比較耗時。此外，離子對試劑對pH值比較敏感，配制流動相時要求精確度較高，直接影響了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和重現(xiàn)性。

HPLC因其快速、準(zhǔn)確、測試條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，在有機(jī)化合物分離、分析中發(fā)揮著重要作用。本文擬建立一種更為簡單的HPLC方法，通過改變流動相組成(包括流動相種類、有機(jī)相比例、緩沖鹽濃度)和檢測波長來優(yōu)化色譜條件，實(shí)現(xiàn)對鹽酸阿考替胺三水合物快速、準(zhǔn)確的測定，為鹽酸阿考替胺三水合物的合成和提純工藝質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)。

圖1 鹽酸阿考替胺三水合物結(jié)構(gòu)圖

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與主要試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配有四元泵(包含真空脫氣機(jī))，自動進(jìn)樣器，智能型柱溫箱，二極管陣列檢測器(DAD)。

甲醇、乙腈均為HPLC級，購自Honeywell公司(Honeywell Burdick & Jackson,Muskegon,MI,USA)；乙酸銨為分析純(購自南京化學(xué)試劑有限公司，南京)；冰乙酸為分析純(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海)，氨水為分析純(購自南京化學(xué)試劑有限公司，南京)；純凈水(購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，杭州)。

鹽酸阿考替胺三水合物對照品(≥99.5%)和粗品均購自南京復(fù)興生物有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18柱(4.6 mm × 150 mm,5 μm)購自月旭材料科技(上海)有限公司；柱溫30℃；流動相：甲醇-20 mmol/L乙酸銨水溶液 = 45∶55(V/V)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長280 nm。

1.3 對照溶液及樣品溶液的配制

精確稱取鹽酸阿考替胺三水合物對照品25 mg于25 mL容量瓶中，以流動相溶解，并定容，配制成1 mg/mL的儲備溶液，分別用流動相稀釋成0.5、0.4、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001、0.0006、0.0005和0.0001 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，待用。

精確稱取鹽酸阿考替胺三水合物粗品10 mg于25 mL容量瓶中，以流動相溶解并定容。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相種類的選擇

分別用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸銨水溶液、乙腈-乙酸銨水溶液作為流動相。以甲醇-水和乙腈-水分別作為流動相時，鹽酸阿考替胺三水合物峰形展寬嚴(yán)重，而以甲醇-乙酸銨水溶液和乙腈-乙酸銨水溶液作為流動相時，樣品的保留時間合適且峰形較好，這是由于鹽酸阿考替胺三水合物為兩性化合物，必須在一定的pH緩沖環(huán)境下才能得到好的峰形?？紤]甲醇的毒性較乙腈低，且價格較便宜，故選擇甲醇-乙酸銨水溶液作為流動相。

2.2 有機(jī)調(diào)節(jié)劑比例的選擇

固定其他色譜條件不變，通過改變流動相中甲醇的比例優(yōu)化鹽酸阿考替胺三水合物的分離(見圖2)。從圖2中可以看出，55%甲醇時，雜質(zhì)1、2重疊在一起并與主峰部分重疊；50%甲醇時，雜質(zhì)1、2分離雖有改善，雜質(zhì)2與主峰依然沒有完全分離。隨著甲醇比例的降低，主峰與雜質(zhì)峰均得到良好分離，但當(dāng)甲醇比例下降至40%時，雜質(zhì)4在50 min時還沒有完全出峰；而當(dāng)甲醇比例降至35%時，50 min內(nèi)雜質(zhì)3和4都未出峰?？紤]到主峰與雜質(zhì)峰的分離情況以及合適的分析時間，甲醇比例選擇45%為最佳有機(jī)調(diào)節(jié)劑比例。該條件下，鹽酸阿考替胺三水合物出峰時間為8 min，總分析時間為23 min，優(yōu)于文獻(xiàn)[17]中報道方法。

圖2 鹽酸阿考替胺三水合物粗品在不同甲醇比例下的色譜圖

2.3 緩沖溶液pH值的選擇

保持乙酸銨濃度為20 mmol/L不變，用冰乙酸或氨水分別調(diào)節(jié)其pH值在5.5～7.5之間?？疾炝鲃酉嗟膒H值對保留時間及峰形的影響。結(jié)果表明，pH值的改變對保留時間影響不大，只會影響鹽酸阿考替胺三水合物的峰形。當(dāng)pH值在6.5～7.0之間時主峰峰形對稱性均良好，本實(shí)驗(yàn)選擇緩沖溶液的pH=6.8。

2.4 緩沖鹽濃度的選擇

保持其他條件不變，分別配制10、15、20、30、40、50 mmol/L的乙酸銨緩沖溶液(pH=6.8)進(jìn)行樣品測定，分析結(jié)果顯示，當(dāng)緩沖鹽濃度小于20 mmol/L時，鹽酸阿考替胺三水合物保留不穩(wěn)定，當(dāng)緩沖鹽濃度在20～50 mmol/L之間時，峰形良好，保留穩(wěn)定且差異不大，考慮高濃度緩沖鹽對色譜柱可能的損傷，故選擇緩沖鹽濃度為20 mmol/L。

2.5 檢測波長的選擇

用二極管陣列檢測器在210～400 nm波長下進(jìn)行掃描，鹽酸阿考替胺三水合物的紫外特征吸收波長為220 nm、280 nm和355 nm(圖3)，其中，220 nm為末端吸收，甲醇和乙酸銨在此波長下會有較強(qiáng)的背景吸收，而280 nm比355 nm吸收要強(qiáng)，因此選擇280 nm為檢測波長。

圖3 鹽酸阿考替胺三水合物紫外吸收光譜

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線與方法檢出限

以峰面積(A,μV·S)對標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(ρ,mg/mL)進(jìn)行線性回歸，在0.0006～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，鹽酸阿考替胺三水合物線性良好，線性回歸方程為Y=34.57+17083.72X，相關(guān)系數(shù)r2=0.9998。其中對濃度為0.002 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，鹽酸阿考替胺三水合物峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.14%。在3倍信噪比(S/N=3)時，測得方法的檢出限(LOD)為0.0002 mg/mL，10倍信噪比(S/N=10)時，測得方法的定量限(LOQ)為0.0006 mg/mL。

3 樣品分析

精確稱取鹽酸阿考替胺三水合物粗品10 mg于25 mL容量瓶中，以流動相溶解并定容，連續(xù)配制5份，每份樣品重復(fù)進(jìn)樣2次并用外標(biāo)法進(jìn)行日內(nèi)含量測定。以同樣方法每天配制一份鹽酸阿考替胺三水合物粗品溶液，連續(xù)配制5天，進(jìn)行日間含量測定，測定結(jié)果見表1。日間、日內(nèi)含量在91.31%～92.68%之間，RSD均小于1%，表明方法具有良好的精密度，適用于鹽酸阿考替胺三水合物工業(yè)品的分析。

表1 鹽酸阿考替胺三水合物樣品測定

4 結(jié)語

針對鹽酸阿考替胺三水合物的結(jié)構(gòu)，采用HPLC法對其進(jìn)行分析測定，主要難點(diǎn)是選擇合適的緩沖鹽和合適的pH值，提高分析的重復(fù)性和可操作性。本研究建立的HPLC方法采用C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱為主流通用柱，以甲醇-乙酸銨水溶液(20 mmol/L，pH 6.8)作流動相有利于色譜系統(tǒng)的快速平衡。該方法為鹽酸阿考替胺三水合物藥物的快速分析提供了基礎(chǔ)，可用于鹽酸阿考替胺三水合物工業(yè)品的檢測，并用于原料藥的質(zhì)量控制。

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