雷公藤氯內(nèi)酯醇對大鼠海馬背側(cè)注射Aβ25-35后膠質(zhì)細(xì)胞及p38MAPK激活的抑制作用

王元偉，鄭關(guān)毅，陳曉春，張 靜，黃天文，葉 洪，潘曉東

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院福建省老年醫(yī)學(xué)研究所，福建福州 350001;2.江蘇省沭陽縣人民醫(yī)院，江蘇沭陽 223600)

阿爾采末病(Alzheimer’s disease，AD)的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其中β淀粉樣肽(Betaamyloid，Aβ)是 AD 形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素［1］，Aβ異常沉積導(dǎo)致的膠質(zhì)細(xì)胞的活化及炎癥反應(yīng)可能在AD病理損傷中起著重要的作用。

雷公藤內(nèi)酯醇是雷公藤的主要有效成分之一，是從衛(wèi)矛科植物雷公藤分離出的一種環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，有較強(qiáng)的抗炎及免疫抑制活性，雷公藤氯內(nèi)酯醇(tripchlorolide，T4)是雷公藤內(nèi)酯醇氯化后的產(chǎn)物，藥理作用和雷公藤內(nèi)酯醇相似，但是其不良反應(yīng)較低，無致突變作用，且能通過血腦屏障［2］，因而很可能有治療AD的潛在價(jià)值。Aβ是由39～43個(gè)氨基酸組成的一種蛋白，其發(fā)揮毒性的主要部位在第25 －35氨基酸之間(Aβ25－35)，Aβ25－35具有神經(jīng)毒性，可使海馬和隔區(qū)神經(jīng)元發(fā)生凋亡［3］。因此本研究應(yīng)用神經(jīng)毒性較強(qiáng)的Aβ25－35片段海馬背側(cè)注射的方法建立大鼠模型，結(jié)合免疫組化、蛋白印跡、ELISA、Nissl染色和TUNEL染色等技術(shù)，探討T4保護(hù)注射Aβ25－35后大鼠海馬神經(jīng)元損傷的作用與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，AS)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)中p38MAPK激活的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物 實(shí)驗(yàn)動物，♂ Sprauge-Dawley大鼠，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證號:SCXK滬2003－0003)。體質(zhì)量220～270 g，自由飲食，室溫22～25℃，每日光照12 h。

1.2 試劑及抗體 Aβ25－35購自 Sigma公司，β-actin單克隆抗體購自NeoMarkers公司，ox-42單克隆抗體購自德國Acris公司，GFAP單克隆抗體購自Neo-Markers公司，p-p38MAPK抗體購自 Santa Cruz公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自德國羅氏公司，TNF-α，IL-1β雙抗夾心ELISA Kit及ELISA裂解液購自武漢博士德生物科技有限公司，即用型免疫組化試劑盒購自LAB VISION公司，Western blot化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自KPL公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 凝聚態(tài)Aβ25-35的制備 1 mg Aβ25－35溶于100 μl滅菌生理鹽水中，制成10 g·L－1濃度，密封后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中5 d成凝聚態(tài)。

1.4 動物模型的建立與分組 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為，Aβ25－35模型組:在10%氯胺酮腹腔注射麻醉下，用腦立體定位儀(Stoelting USA)固定大鼠，取平顱頭位，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，確定右(左)側(cè)前囟后－3.8 mm、中線旁2.5 mm、顱骨表面下3.0 mm為右(左)海馬背側(cè)部，用1μl微量注射器5min內(nèi)緩慢注入 Aβ25－351μl，予以留針5 min。術(shù)后給予青霉素鈉鹽10萬單位肌注，分別于 d 1、d 2、d 4、d 7處死大鼠。T4處理組:模型制備前先腹腔內(nèi)注射T4，每天1次，連續(xù)3 d，d 4海馬背測注射 Aβ25－35制備模型，模型制備同時(shí)及其后繼續(xù)給予腹腔內(nèi)注射T4，每天 1 次，直到所規(guī)定的時(shí)間段 1、2、4、7 d 標(biāo)本收集時(shí)為止。處理組依 T4劑量的不同(分別為5.0、10.0 和 20.0 μg·kg－1)分為 3 組。生理鹽水注射組:腹腔內(nèi)注射生理鹽水。正常對照組:不做任何處理。本實(shí)驗(yàn)共分為對照組，生理鹽水注射組，模型1 d、2 d、4 d、7 d組，每組 21 只，共 126 只;T4(5.0、10.0 和20.0 μg·kg－1)組，根據(jù) Aβ25-35注射后取材時(shí)間的不同分為4個(gè)亞組，每組21只，共252只。以上各組各分總數(shù)的1/3大鼠用于相關(guān)染色計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，1/3用于蛋白印跡，1/3用于ELISA測定。正常組和假注組在d 1取材，余各組在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn) 1、2、4、7 d 取材。

1.5 標(biāo)本收集

1.5.1 組織學(xué)標(biāo)本 大鼠用10%氯胺酮深麻醉，然后4%多聚甲醛300 ml進(jìn)行左室快速注射內(nèi)固定，取出腦組織，冠狀切取視交叉和乳頭體，留取中間組織塊，繼續(xù)浸泡于4%多聚甲醛中24 h。組織塊經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋成蠟塊，冠狀切成厚2 μm薄片，主要用于免疫組織化學(xué)染色，Nissl染色和TUNEL染色。

1.5.2 組織勻漿的制備 大鼠經(jīng)10%氯胺酮深麻醉后，以4℃生理鹽水50 ml行左室灌洗，即刻斷頭取出海馬。用于蛋白免疫印跡的標(biāo)本，按1∶6加入勻漿緩沖液研磨成組織勻漿，10 000×g離心10 min，取上清，置－20℃冰箱貯存;用于 ELISA的標(biāo)本，按1∶10加入ELISA裂解液研磨成組織勻漿，10 000×g離心10 min，取上清，置－20℃冰箱貯存。

1.5.3 TUNEL染色 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自德國羅氏公司。切片常規(guī)處理后，按說明書操作，細(xì)胞核呈棕黃色者為陽性細(xì)胞。

1.5.4 Nissl染色 組織切片常規(guī)脫蠟、逐級乙醇脫水及水洗，加入亞甲藍(lán)染液浸泡10 min，0.2 mol·L－1乙酸鹽(pH 4.6)分色2 min，陽性染色者胞核染色淡，胞質(zhì)藍(lán)染，即為存活的正常神經(jīng)元。

1.5.5 免疫組織化學(xué) 切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，一抗(ox-42 1∶50、GFAP 1 ∶200、p-p38MAPK 1 ∶100)4℃孵育過夜，在室溫下以生物素標(biāo)記的二抗和SABC試劑(Ultravision Detection System)各浸泡30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、最后用中性樹膠封固。陰性對照組PBS代替一抗進(jìn)行上述操作。陽性細(xì)胞為胞質(zhì)和突起呈棕黃色。

1.5.6 蛋白免疫印跡 用Bradford法對提取的標(biāo)本進(jìn)行蛋白定量。然后各取等量樣品，加入等體積的2×上樣緩沖液混勻，于100℃沸水中煮120 s，以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)到PVDF膜，用封閉液(Protein detector Western blot kit，KPL 公司，USA)室溫下封閉1 h，加入封閉液稀釋的(1∶1 000)一抗pp38MAPK 4℃孵育過夜;洗滌液洗3×5 min，1×10 min;辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)孵育2 h，用化學(xué)發(fā)光法顯色，X線底片曝光。以βactin為內(nèi)參照。

1.5.7 ELISA 大鼠海馬勻漿離心后取上清，根據(jù)試劑盒說明書所示的操作方法，用酶標(biāo)儀測定樣品在450 mm的吸光值(A450值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線回歸分析，得出其直線回歸方程。將測得的不同待檢標(biāo)本的A值代入相應(yīng)的直線回歸方程中，即可得TNF-α、IL-1β的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù):在高倍鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)5個(gè)非連續(xù)視野陽性細(xì)胞數(shù)之和為每例陽性細(xì)胞數(shù)，每組7例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，SPSS 11.0軟件包行單因素方差分析，方差齊者組間比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Games-Howell檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 T4對大鼠海馬組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響如Fig 1所示，在模型組可觀察到活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，隨時(shí)間延長逐漸增多，以d 7數(shù)量最多，T4干預(yù)后，大鼠海馬組織活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少(7 d)，以20 μg·kg－1組為明顯，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見Tab 1，說明T4對注射Aβ25－35后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有抑制作用。

2.2 T4對大鼠海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響如Fig 2所示，在模型組可觀察到活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，胞體增大，突起變粗，染色較深，隨時(shí)間延長逐漸增多，以d 7數(shù)量最多，T4干預(yù)后，大鼠海馬組織活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少(7 d)，以20 μg·kg－1組明顯，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見Tab 1，說明T4對注射Aβ25－35后星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活有抑制作用。

Fig 1 Immunohistochemistry of rat hippocampal sections(CA1 area)with ox-42 antibody(×400)

Fig 2 Immunohistochemistry of rat hippocampal sections(CA1 area)with GFAP antibody(×400)

Tab 1 Positive results of ox-42，GFAP，p-p38MAPK

2.3 T4對大鼠海馬組織p38MAPK激活的影響

2.3.1 免疫組織化學(xué) 如Fig 3所示，與正常組和生理鹽水假注射組相比較模型組觀察到大量的pp38MAPK陽性細(xì)胞，以d 7模型組數(shù)量最多，T4處理后，與模型組相比，大鼠海馬組織p-p38MAPK陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸減少(7 d)，以 20 μg·kg－1組為明顯，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見Tab 1，說明T4在此劑量范圍內(nèi)以時(shí)間－劑量依賴的方式抑制p38MAPK激活。

2.3.2 蛋白免疫印跡 從 Fig 4可以觀察到 pp38MAPK的表達(dá)高峰在7 d，T4干預(yù)處理后 pp38MAPK條帶密度有降低的趨勢，以20 μg·kg－1較明顯。說明T4能抑制Aβ25-35注射后p-p38MAPK的表達(dá)。

Fig 3 Immunohistochemistry of rat hippocampal sections(CA1 area)with p-p38MAPK antibody(×400)

Fig 4 Western blot of p-p38MAPK protein

2.4 T4對大鼠海馬組織神經(jīng)元損傷的影響TUNEL及Nissl染色如Fig 5所示，模型組TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)量隨時(shí)間延長逐漸增多，并于7 d達(dá)到高峰，T4干預(yù)后，TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(7 d)，以20 μg·kg－1組明顯;如 Fig 6 所示，模型組隨著時(shí)間的延長，海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元數(shù)量逐漸變的稀少且排列紊亂，可見有尼氏體碎裂，胞質(zhì)中央尼氏體消失或胞質(zhì)低嗜堿性染色，Nissl陽性神經(jīng)元明顯減少(7 d)，T4干預(yù)后，Nissl陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，以 20μg·kg－1組明顯，說明 T4對注射Aβ25－35后海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見Tab 2。

2.5 ELISA檢測T4處理對海馬內(nèi)TNF-α和IL-1β的含量變化的影響 T4可以明顯的抑制TNF-α(Tab 3)和 IL-1β(Tab 4)的分泌，以 T4(20 μg·kg－1)組效果最明顯，與模型組相比，T4(20 μg·kg－1)組在d 1就可以明顯的抑制此二者的升高(P＜0.05)，d 7效果更明顯(P＜0.01)。

Fig 5 Rat hippocampal sections(CA1 area)with TUNEL staining(×400)

Fig 6 Rat hippocampal sections(CA1 area)with Nissl staining(×400)

Tab 2 Positive results of Nissl，TUNEL staining

Tab 3 Inhibitory effect of T4on Aβ25-35induced increase of TNF-α level in rat hippocampus

Tab 4 Inhibitory effect of T4on Aβ25-35induced increase of IL-1β in rat hippocampus

3 討論

AD中Aβ周圍出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，促炎細(xì)胞因子、神經(jīng)毒性物質(zhì)的釋放，細(xì)胞內(nèi)鈣超載等一系列生化改變，其中包括腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)的釋放，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，并誘導(dǎo)多種凋亡基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的瀑布效應(yīng)。

本研究表明，MG、AS、p38MAPK激活或表達(dá)在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡中起著重要的作用。針對上述靶點(diǎn)的藥物被證實(shí)有神經(jīng)保護(hù)作用。Giovannini等［4］發(fā)現(xiàn)在AD模型中消炎藥布洛芬可以明顯抑制膠質(zhì)細(xì)胞和p38MAPK的激活，降低IL-1β的水平發(fā)揮保護(hù)膽堿能神經(jīng)元的作用。

T4能通過激活Wnt/β-catenin通路減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡［5］。本研究表明，在Aβ25－35引起的大鼠海馬神經(jīng)元損傷模型中，經(jīng)T4處理后，海馬神經(jīng)元凋亡在d 7明顯減少，證實(shí)了T4有一定的神經(jīng)元保護(hù)作用。且隨著T4劑量的增加，保護(hù)作用更強(qiáng)。Aβ可直接激活小膠質(zhì)細(xì)胞，誘發(fā)其產(chǎn)生白介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、TNF-α 等多種炎性細(xì)胞因子，并誘導(dǎo)補(bǔ)體系統(tǒng)，補(bǔ)體系統(tǒng)隨著IL-1的表達(dá)，進(jìn)一步活化小膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子或毒性物質(zhì)［6－9］，同時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放 IL-1β［10－11］，繼發(fā)活化 AS，促進(jìn)其增殖，釋放多種免疫活性因子啟動炎癥反應(yīng)［12］。這種交互作用促成了慢性炎癥反應(yīng)的形成和炎性產(chǎn)物水平持續(xù)升高，導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死，退變死亡的神經(jīng)元碎片及有毒物質(zhì)反過來又刺激其他膠質(zhì)細(xì)胞釋放神經(jīng)毒性物質(zhì)和炎性細(xì)胞因子，這樣在腦內(nèi)就形成一個(gè)不斷增強(qiáng)的自身毒性環(huán)路，使炎癥反應(yīng)不斷加強(qiáng)。T4還可以抑制Aβ所致小膠質(zhì)細(xì)胞活化，改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［13］。本研究亦表明，Aβ25－35可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α及IL-1β，予一定劑量的T4處理后，小膠質(zhì)細(xì)胞激活受到抑制，并且TNF-α和IL-1β的含量降低，以20 μg·kg－1最明顯，呈劑量 － 時(shí)間效應(yīng);同時(shí)星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活也被抑制，同小膠質(zhì)細(xì)胞的變化趨勢一致。更大的劑量對膠質(zhì)細(xì)胞是否有更好的抑制作用有待于進(jìn)一步研究。

Nagila等［14］發(fā)現(xiàn)p38MAPK通路的激活可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。p38MAPK一旦被激活，迅速從胞質(zhì)內(nèi)移位到細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子［15］，引起大量凋亡因子及相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而引起神經(jīng)元凋亡。Pan等［16］在小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)寡聚態(tài)Aβ1－42激活 JNK、NF-κB 信號通路而不是 p38MAPK通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng);T4能抑制寡聚態(tài)Aβ1－42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)JNK和NF-κB炎癥信號的激活水平保護(hù)神經(jīng)元，但不影響p38MAPK的活化水平。在體內(nèi)p38MAPK信號通路是否參與了Aβ誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放，T4能否對p38MAPK的活化水平產(chǎn)生影響系本研究觀察的重點(diǎn)。本研究觀察到，Aβ作用后海馬組織p38MAPK的表達(dá)明顯增強(qiáng)，T4處理后，模型組的大鼠海馬組織p38MAPK的表達(dá)明顯降低，以20 μg·kg－1作用最明顯。在 p38MAPK 表達(dá)降低的同時(shí)，TNF-α和IL-1β的水平也有明顯的降低。因此T4對Aβ25－35引起的大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，可能是通過抑制p38MAPK信號通路，減少炎癥細(xì)胞因子水平來實(shí)現(xiàn)的。

本研究表明:T4可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞，p38MAPK信號通路的激活，降低TNF-α和IL-1β的水平，對Aβ25－35引起的大鼠海馬神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。

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