海帶巖藻多糖的提取工藝優(yōu)化及初步結(jié)構(gòu)分析

李國瑩，袁 方，羅 瑋，李漢廣，余曉斌，*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122；2.齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353）

巖藻多糖（fucoidan）一種復(fù)雜的硫酸酯多糖，主要成分為L-巖藻糖（fucose）、硫酸基團(tuán)，還包括半乳糖、木糖和甘露糖等成分[1]，存在于褐藻的細(xì)胞壁基質(zhì)中[2]。它具有多種生物學(xué)活性[3]，如抗凝血、抗氧化、抗血栓、抗癌等功效[4-7]，成為中外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。海帶一種大型褐藻且資源豐富，可為巖藻多糖的研究與開發(fā)提供原料保證。

由于褐藻中巖藻多糖含量低且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，高純度巖藻多糖價(jià)格昂貴，為使優(yōu)質(zhì)巖藻多糖生產(chǎn)進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化，巖藻多糖的提取工藝一直備受關(guān)注[8]，采取傳統(tǒng)提取過程中添加輔助提取步驟，從而提高多糖提取率，如酶法[9]、超聲波[10]、微波[11]超濾[12]等技術(shù)應(yīng)用于多糖的提取。程仕偉等[13]水提制備海帶巖藻多糖提取率為4.99%，而崔艷麗等[14]利用復(fù)合酶酶解法提取巖藻多糖提取率為13.9%，可見輔助方法的添加與傳統(tǒng)提取工藝相比，具有更高的提取率。

本實(shí)驗(yàn)采用高壓均質(zhì)與酶法結(jié)合提取巖藻多糖，采用高壓均質(zhì)處理原料提取巖藻多糖的報(bào)道鮮有。高壓均質(zhì)與酶共同作用，促使細(xì)胞間質(zhì)中多糖充分溶出。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝進(jìn)一步提高得率，利用紅外及色譜技術(shù)初步檢測自制巖藻多糖的成分及結(jié)構(gòu)，為巖藻多糖的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶 市售；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、10種單糖標(biāo)準(zhǔn)物Sigma公司；纖維素酶、木瓜蛋白酶 南寧東恒華道生物科技有限公司；所用其他試劑 均為分析純。

粉碎機(jī) 常州五谷農(nóng)場食品有限公司；膠磨機(jī)上海正奧泵業(yè)制造有限公司；可見光分光光度計(jì) 上海精科；紫外分光光度計(jì) 海優(yōu)尼科；冷凍離心機(jī)Thermo公司；冷凍干燥機(jī) Virtis公司；FEI Quanta 200掃描電子顯微鏡 FEI公司；HPGLC Waters公司；ICS-5000離子色譜儀 Dionex公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海帶預(yù)處理 海帶洗凈曬干，粉碎，酒精∶三氯甲烷∶水（4∶2∶1）脫脂，過濾，烘干。將粉碎機(jī)、膠磨機(jī)、高壓均質(zhì)機(jī)處理得到不同的海帶漿分別提取巖藻多糖，考察不同預(yù)處理方式對(duì)多糖得率的影響，選取最佳的海帶處理方法。

1.2.2 巖藻多糖提取 取適量海帶漿，水浴55℃，加入酶（纖維素酶、木瓜蛋白酶）適量，酶解2h，溫度升至90℃，10min使酶失活，離心取上清液，上清液加CaCl2溶液，離心取上清，加乙醇，使其終濃度為60%，4℃過夜，離心，棄上清。沉淀依次用乙醚，丙酮洗滌，冷凍干燥，巖藻多糖粗糖。

1.2.3 單因素及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)基本條件為：料水比1∶20，酶用量1.0%，酶解pH5.0，酶解溫度50℃。改變其中一個(gè)條件，固定其他條件分析所選因素對(duì)巖藻多糖得率的影響。各因素梯度分別為：料水比：1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40；酶用量：1%、1.5%、2%、2.5%、3%；酶解pH：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0；酶解溫度（℃）：35、40、45、50、55、60。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面分析軟件Box-Behnken Design（BBD）模型，設(shè)料水比（A）、酶解pH（B）、酶用量（C）三因素為自變量，巖藻多糖得率Y為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，確定提取工藝的最佳參數(shù)，實(shí)驗(yàn)因素與水平取值見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.3 測定方法

1.3.1 粗多糖得率的測定 粗巖藻多糖得率（%）=粗多糖質(zhì)量/海帶粉質(zhì)量×100

1.3.2 巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以巖藻糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0135x+0.0066，R2=0.9991。

1.3.3 多糖含量的測定 取適量一定濃度的海帶粗多糖待測液于試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定吸光值，計(jì)算粗糖中多糖的含量。巖藻多糖含量（%）=多糖質(zhì)量/粗多糖總質(zhì)量×100

1.4 巖藻多糖初步結(jié)構(gòu)分析

1.4.1 粗多糖純化 取上述粗多糖溶于水，等體積加入CaCl2溶液，室溫放置，4000r/min離心10min，取上清Sevage法脫蛋白，直到中間層無沉淀產(chǎn)生為止，收集上層液，加乙醇至濃度為60%，4℃放置過夜，8000r/min離心10min，收集沉淀，加水，透析（透析袋截留分子量8000～14000u），冷凍干燥得巖藻多糖，所得多糖用于以下多糖成分分析實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 巖藻多糖紅外光譜分析[16]取多糖1mg與干燥的溴化鉀研磨混勻，壓片，用紅外光譜儀初步分析巖藻多糖結(jié)構(gòu)。

1.4.3 巖藻多糖分子量的測定 采用高效凝膠過濾色譜法[17]（HPGFC），色譜條件：色譜柱：UltrahydrogelTMLinear 300mm×7.8mm id×2；流動(dòng)相：0.1mol/L NaNO3；流速：0.9mL/min；柱溫：45℃；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)樣，繪制分子量校正曲線。所用葡聚糖分子量（Mw）分別為33800、41100、1000、2500u。樣品的前處理：取純化多糖溶解于流動(dòng)相中，用微孔過濾膜過濾后供進(jìn)樣。

1.4.4 巖藻多糖單糖組分分析：離子色譜-脈沖安培法[18]（IC-PAD）色譜條件：色譜柱：CarboPac PA20；流動(dòng)相：H2O，250mmol/L NaOH，1mol/L NaAc；流速：0.5mL/min；檢測器：脈沖安培檢測器。

樣品前處理：稱取多糖樣品1mg，溶于1.0mL 4mol/L三氟乙酸，充氮?dú)夥夤埽?0℃水解1h，冷卻后用氮?dú)獯蹈桑铀?0mL溶解，用微孔過濾膜過濾后供進(jìn)樣。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 8.0，Origin 8.5和Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶粉的處理方法的選擇

以經(jīng)過不同處理的海帶漿為原料，提取巖藻多糖，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知僅經(jīng)粉碎機(jī)處理的海帶粉顆粒大，得率較低；經(jīng)膠體磨處理后，顆粒較細(xì)，得率有所提升；高壓均質(zhì)處理，得率進(jìn)一步提升，可能是由于高壓均質(zhì)具有破壁效果[19]與酶作用使細(xì)胞間質(zhì)的多糖充分溶出因而得率提高，但過高的機(jī)械作用也會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)，如糖鏈的斷裂，SO42-的脫落等。故本實(shí)驗(yàn)參考Rosa M等的研究結(jié)果[20]，選擇高壓均質(zhì)的壓力為200Bar與酶相結(jié)合處理海帶粉，以期獲得更高的得率。

圖1 不同海帶漿的多糖提取結(jié)果Fig.1 polysaccharide extraction result of different kelp

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料水比對(duì)巖藻多糖得率的影響 由圖2可知，隨料水比的增加，巖藻多糖得率明顯提高。是由于加入溶劑量少時(shí)，材料本身吸水膨脹，影響細(xì)胞與酶充分結(jié)合；隨著溶劑量的增大，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出，多糖得率隨之增大。但隨著溶劑量的繼續(xù)增加，多糖得率增加趨于穩(wěn)定，選擇1∶30為自變量料水比的零水平。

圖2 料水比對(duì)巖藻多糖提取的影響Fig.2 Effect of alga/water ratio on extraction of fucoidan

2.2.2 酶用量對(duì)巖藻多糖提取的影響 由圖3可知，未添加酶與添加酶處理相比較，多糖得率提高較明顯，當(dāng)用量達(dá)2.5%時(shí)多糖得率達(dá)最大值，繼續(xù)增大用量得率幾乎無變化，由于加酶濃度達(dá)到一定值，酶分子飽和，底物水解速度增加不再顯著，故選擇2.5%為自變量酶用量的零水平。

圖3 酶用量對(duì)巖藻多糖提取的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on extraction of fucoidan

圖4 pH對(duì)巖藻多糖提取的影響Fig.4 Effect of pH on extraction of fucoidan

2.2.3 pH對(duì)海帶巖藻多糖提取的影響 pH是影響酶活力的重要因素。纖維素酶的最適pH4.0～5.5，木瓜蛋白酶的最適pH6～7。本實(shí)驗(yàn)采用兩種酶復(fù)合作用，結(jié)果如圖4所示，pH＜4.0或pH＞7.0時(shí)，酶的活性降低，多糖得率低；兩種酶混合后最適pH范圍為5.0～6.0，其中pH為5.5時(shí)多糖提取最為理想，選擇5.5為自變量pH的零水平。

2.2.4 溫度對(duì)海帶巖藻多糖提取的影響 溫度是影響酶活力的另一重要因素。纖維素酶的最適溫度在45～65℃，而木瓜蛋白酶的最適合溫度55～65℃。由圖5可知，兩種酶混合后的適合溫度范圍為45～55℃，其中溫度為50℃時(shí)多糖提取最為合適。

圖5 溫度對(duì)巖藻多糖提取的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction of fucoidan

2.3 響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)中，溫度與pH均為酶學(xué)性質(zhì)參數(shù)，但pH對(duì)得率的影響要大于溫度，故在單因素實(shí)驗(yàn)確定的中心點(diǎn)的基礎(chǔ)上，以酶解溫度50℃，酶解時(shí)間2.0h為條件，設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Test design and results of Box-Behnken

2.3.1 數(shù)據(jù)分析 以多糖得率為響應(yīng)值，根據(jù)表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Design Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，該數(shù)學(xué)模型的R2=0.9570，說明該數(shù)學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)擬合較好且可靠性高，可用于預(yù)測巖藻多糖的得率及其優(yōu)化提取條件。

回歸方程為：Y1=14.51+2.26A+1.32B-0.32C+0.83AB-1.07AC+0.6BC-2.39A2-1.30B2-1.32C2，其方差分析見表3。由表3可知，A和B對(duì)Y1的影響均為顯著，尤其因素料水比（A）的影響極為顯著，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道相吻合；由F值可知，3個(gè)因素對(duì)Y影響的排序?yàn)椋毫纤龋久赣昧浚久附鈖H。

表3 模型方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

圖6 各兩因素交互影響巖藻多糖得率的響應(yīng)面圖Fig.6 Each interaction of two factors on fucoidan yield

響應(yīng)面優(yōu)化過程中，所選三個(gè)因素的交互作用的響應(yīng)面圖見圖6。圖6（a）中，隨料水比的增加，多糖得率增加，適當(dāng)增加酶用量也可增加多糖得率；圖6（b）中料水比與pH影響均呈拋物線，二者交互影響較顯著；圖6（c）中酶用量與pH對(duì)多糖得率影響較明顯，但二者的交互作用不顯著。

2.3.2 最優(yōu)值選擇 經(jīng)軟件分析，該模型的最大估計(jì)值為15.42%，對(duì)應(yīng)自變量值為料水比1∶35，酶用量2.57%，酶解pH5.32，故選取料水比1∶35，酶用量2.5%，酶解pH5.32。為確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)上述優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，巖藻多糖得率為14.53%±0.05%，與預(yù)測值15.42%接近，驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，測定多糖含量為75.36%±0.12%。

利用高壓均質(zhì)與酶法結(jié)合，通過響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝后，較傳統(tǒng)提取方法而言，提取時(shí)間縮短，能耗減少，巖藻多糖得率及純度均提高，為獲得優(yōu)質(zhì)巖藻多糖的產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

2.3.3 紅外光譜 巖藻多糖紅外光譜圖（圖7），3425、2925、1616cm-1處吸收峰為糖類特征性吸收峰；1255cm-1附近處是由硫酸基S=O伸縮振動(dòng)引起的，證明巖藻多糖含有硫酸基；1051cm-1處為C-O的伸縮振動(dòng)峰；821cm-1為C-O-S鍵的吸收峰，證明硫酸基連接在糖環(huán)上；在1700～1750cm-1附近未檢測到吸收峰，說明不含糖醛酸[21]，與張文清等[22]報(bào)道巖藻多糖單糖組分不含糖醛酸，結(jié)構(gòu)類似。

圖7 巖藻多糖的紅外光譜圖Fig.7 IR spectrum of fucoidan

圖8 海帶巖藻多糖HPGFC色譜圖Fig.8 HPGFC chromatograms of laminaria japonica fucoidan

2.3.4 巖藻多糖分子量的測定 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣，以葡聚糖的分子量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)與保留時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制分子量校正曲線，得y=-0.43x+12.31，R2=0.991。如圖8所示，分離得到三個(gè)峰，其分子量為別為639、248、79ku，與有關(guān)文獻(xiàn)[23]報(bào)道相差較大，這與原材料不同提取方法不同有關(guān)。

2.3.5 巖藻多糖單糖組成的測定 巖藻多糖水解后產(chǎn)物進(jìn)行IC-PAD分析，如圖9所示，通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間（圖10）比較，得知巖藻多糖樣品由7種單糖組成，分別為巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖；糖含量分別為42.81%、1.95%、1.57%、31.35%、3.30%、5.56%、13.30%，與文獻(xiàn)[23]報(bào)道結(jié)果相近，不含有葡萄糖醛酸，與上述紅外結(jié)果一致。

圖9 海帶巖藻多糖離子交換色譜圖Fig.9 Ion exchange chromatogram of mixed standard solution

圖10 混合標(biāo)準(zhǔn)液離子交換色譜圖Fig.10 Ion exchange chromatogram of mixed standard solution

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化巖藻多糖的提取工藝，其最佳條件為料水比1∶35，酶用量為2.5%，酶解pH為5.32，得率14.53%±0.05%；HPGFC測定巖藻多糖分子量為639、248、79ku；利用IC-PAD檢測巖藻多糖的組成成分及含量為：巖藻糖42.81%、鼠李糖1.95%、阿拉伯糖1.57%、半乳糖31.35%、葡萄糖3.30%、木糖5.56%、甘露糖13.30%。

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