三種重要甘露糖衍生物的合成方法改進及微波輔助合成

王 偉，成向榮，2，施用暉，2，樂國偉，2，*

（1.江南大學食品學院，食品營養(yǎng)與功能因子研究中心，江蘇無錫 214122；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

國內外的研究已經證實，D-甘露糖在食品工業(yè)、飼料工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)和生命科學等研究中具有重要的作用[1]；其聚合物形式甘露聚糖具有免疫原性，能夠刺激機體免疫應答，促進生長，調節(jié)動物腸胃微生物生態(tài)系統(tǒng)，治療肥胖癥，吸附霉毒素等功效[2-3]；甘露糖蛋白在細胞識別、HIV感染、病體惡化等方面起著很重要的作用[4-5]。

近年來，微波輻射技術在有機合成中應用日趨廣泛，它可以使反應速率大大加快提高收率。常規(guī)條件下需要十幾個小時完成的反應在微波條件下往往僅需數(shù)分鐘或數(shù)秒鐘即可完成，并且通常收率較高[6]。微波作為一種反應條件，可以減少一些有毒有害催化劑或者試劑的使用，同時一些熱力學上不能發(fā)生的反應在微波條件可以發(fā)生[7]。

本文就1，2，3，4，6-五-O-乙?；?β-D-甘露糖（本文中采用A代替此化合物名稱）、2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-溴-α-D-甘露糖（采用B代替此化合物名稱）、3，4，6-三-O-乙酰基-1，2-O-烯丙氧基亞乙基-β-D-甘露糖（采用C代替此化合物名稱）三個重要的甘露糖衍生物的合成方法進行了較為詳實的研究，這三種產物均為重要的甘露糖衍生物，它們的合成為低聚甘露糖、甘露糖蛋白的后續(xù)合成做了良好的鋪墊。通過對幾種方法的產率、繁簡程度、環(huán)保性等方面的比較，對現(xiàn)有方法進行了改進。首次通過微波輻射技術合成了上述三種產物，并在單因素實驗基礎上，通過正交實驗得到了最佳合成工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GF254硅膠層析板 青島海洋化工廠；200～300目柱層析用硅膠 青島海洋化工廠；4A分子篩、甘露糖、乙酸酐、乙酸鈉、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、甲醇鈉、乙酰溴 國藥集團化學試劑有限公司；溴化氫乙酸溶液 上海泰諾化工有限公司；烯丙醇山東鄒平銘興化工有限公司；所用試劑 如無特殊說明均為分析純試劑。

XH-200A型微波固液相合成儀 北京祥鵠公司；R-205型旋轉蒸發(fā)儀 無錫申科公司；UPLCTQD型超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用儀 美國waters公司；Bruker ARx-400型核核磁共振儀儀 TMS內標，瑞士Bruker公司。

1.2 反應路線圖

圖1 反應路線路Fig.1 Synthetic route

1.3 傳統(tǒng)方法合成

1.3.1 乙酸鈉-乙酸酐法合成產物A 主要方法參考文獻[8]。本文改進之處在于原料混合后分批加入，并采用梯度升溫控制反應溫度。

1.3.2 高氯酸-乙酸-乙酸酐法合成產物A 主要方法參考文獻[9]。本文改進之處在于采用冰浴控制反應溫度在20℃以下及在體系中緩慢滴加HClO4。

1.3.3 全乙?；事短?乙酰溴分步法合成產物產物B 主要方法參考文獻[8]。本文改進之處在于采用冰浴下滴加乙酰溴并在棕色瓶下避光反應。

1.3.4 HBr-CH3COOH一鍋法合成產物B 主要方法參考文獻[10]。本文改進之處在于在冰水浴中加入原料，采用滴加溴化氫乙酸的方法，并將體積濃度為45%溴化氫乙酸溶液改為13%。

1.3.5 烯丙醇-2，6-二甲基吡啶法合成產物C 主要方法參考文獻[13-14]。本文改進之處在于采用2，6-二甲基吡啶代替2，4-二甲基吡啶作為原料進行反應。

1.4 新型微波輔助合成

1.4.1 微波輔助法合成產物A 原料配比、反應步驟同1.3.1。微波功率設定為800W攪拌，溫度設定70℃，反應20min TLC（石油醚∶乙酸乙酯=3∶1）顯示反應結束。

1.4.2 微波輔助法合成產物B 原料配比、反應步驟同1.3.4。微波功率設定為400W攪拌，溫度設定25℃，反應0.6hTLC（石油醚∶乙酸乙酯=2∶1）顯示反應結束。

1.4.3 微波輔助法合成產物C 原料配比、反應步驟同1.3.5。微波功率設定為500W攪拌，溫度設定30℃，反應30min TLC（石油醚∶乙酸乙酯=1∶1）顯示反應結束。

1.4.4 產率結算公式 各物質產率=經過柱純化后所得質量數(shù)（g）/理論產量（g）

1.5 微波輔助合成法單因素實驗

1.5.1 產物A單因素實驗 選取微波功率分別為200、400、600、800、1000W，反應時間分別為10、15、20、25、30min，反應溫度分別為40、50、60、70、80℃，甘露糖與乙酸酐摩爾比1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15，各因素固定水平分別為800W、20min、70℃、1∶11，考察不同因素的不同水平對產物產率的影響。

1.5.2 產物B單因素實驗 微波功率分別為200、300、400、500、600W，微波反應時間分別為20、30、40、50、60min，反應溫度分別為20、25、30、35、40℃，乙酸酐與溴化氫乙酸溶液體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，各因素固定水平分別為400W、40min、25℃、1∶3，考察不同因素的不同水平對產物產率的影響。

1.5.3 產物C單因素實驗 微波功率分別為300、400、500、600、700W，反應時間分別為10、20、30、40、50min，反應溫度分別為25、30、35、40、45℃，2，6-二甲基吡啶與2，3，4，6-四-O-乙?；?1-溴-α-D-甘露糖摩爾比1∶2、3∶4、1∶1、5∶4、3∶2，各因素固定水平分別為500W、30min、35℃，1∶1，考察不同因素的不同水平對產物產率的影響。

1.6 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，采用4因素3水平的正交設計實驗表L9（34）。由于產物A的單因素實驗中產率已經達到98.3%，所以未對其進行正交設計實驗，采用單因素實驗中的較優(yōu)條件進行驗證實驗。產物B、C的正交設計實驗見表1、表2。

表1 產物B實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test of product B

表2 產物C實驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test of product C

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 20.0對實驗數(shù)據(jù)繪圖及方差分析。

2 結果與討論

2.1 傳統(tǒng)方法改進

1.3.1 中，得到產物A 3.61g，產率92.6%；1.3.2中產率97.2%，與參考文獻[9]相比，通過控制反應溫度及滴加速度優(yōu)化了反應條件，產率提高5.2%。

1.3.3中，得到產物B 4.17g，產率92.1%，采用冰浴下滴加乙酰溴并在棕色瓶下避光反應，有效地防止了副產物的產生。1.3.4中，“一鍋法”可以簡化合成步驟且對環(huán)境友好，得到產物10.49g，產率91.8%，反應條件的優(yōu)化在于在冰水浴中加入原料，采用滴加溴化氫乙酸的方法，這樣避免了加入原料時的大量放熱，從而避免了副產物產生，相比于參考文獻[10]中質量濃度45%溴化氫乙酸溶液，本文采用13%濃度，原因在于高濃度的溴化氫反應后副產物增多，且出現(xiàn)不溶性深色雜質，產率僅為55%～75%。

產物C的合成，國內外文獻報道中，此化合物的合成方法較少，但是孔繁祚小組發(fā)現(xiàn)了一種利用其快速合成甘露低聚糖糖基受體的方法[11-12]，應用前景十分廣泛。1.3.5中，得到產物C 6.66g，產率85.8%。文獻[13-14]中，采用2，4-二甲基吡啶作為原料進行反應，經過筆者多次實驗求證，2，6-二甲基吡啶具有相同的效果，且毒性更低，沸點更低，在后續(xù)減壓蒸餾過程中更容易除去。

2.2 產物A的微波合成方法單因素實驗結果

2.2.1 微波功率對產率的影響 由圖2可知，提高功率產率增加，當增加到800W，微波功率對結果基本沒影響，功率過大產率反而下降。

圖2 微波功率對產率的影響Fig.2 Effect of microwave power on the yield

2.2.2 反應時間對產率的影響 由圖3可知，增加反應時間產率增加，20min達到最高產率，增加反應時間產率反而有所下降，但是下降并不明顯，反應時間對產率的影響較小。

2.2.3 反應溫度對產率的影響 由圖4可知，提高反應溫度產率增加，當溫度增加至70℃時，反應溫度對產率基本沒影響，但是進一步升高溫度，產率下降明顯。原因可能在于溫度過高會使甘露糖發(fā)生碳化，導致產率降低。

圖3 反應時間對產率的影響Fig.3 Effect of reaction time on the yield

圖4 反應溫度對產率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the yield

2.2.4 甘露糖與乙酸酐摩爾比對產率的影響 由圖5可知，減小甘露糖與乙酸酐摩爾比，產率增加，摩爾比1∶11時產率最大，進一步減小摩爾比產率下降，且下降比較明顯。原因可能在于增大乙酸酐用量，有利于反應向生成酯的方向進行，但乙酸酐量過多時則一定程度上抑制了該反應的進行。

圖5 摩爾比對產率的影響Fig.5 Effect of mole ratio on the yield

2.3 產物B的微波合成方法單因素實驗結果

2.3.1 微波功率對產率的影響 由圖6可知，提高功率產率增加，當增加到400W時產率最大，提高微波功率產率下降。可能由于功率的升高不易于溴代反應，導致副產物增加，產率下降明顯。正交實驗選取微波功率300、400、500W三個水平。

圖6 微波功率對產率的影響Fig.6 Effect of microwave power on the yield

圖7 反應時間對產率的影響Fig.7 Effect of reaction time on the yield

2.3.2 反應時間對產率的影響 由圖7可知，增加反應時間產率提高，40min達到最高產率，增加反應時間產率反而有所下降，但是下降并不明顯。正交實驗選取反應時間30、40、50min三個水平。

2.3.3 反應溫度對產率的影響 由圖8可知，25℃達到最高產率，隨著反應溫度的增加，產率逐漸降低，當溫度增加至30℃之后，產率下降明顯。這可能是由于溫度升高致使溴化物變得不穩(wěn)定，容易在端位發(fā)生分解。正交實驗選取反應溫度20、25、30℃三個水平。

圖8 反應溫度對產率的影響Fig.8 Effect of reaction temperature on the yield

2.3.4 乙酸酐與溴化氫乙酸溶液的體積比對產率的影響 由圖9可知，乙酸酐與溴化氫乙酸溶液體積比隨著比例的減小產率提高，體積比為1∶3時產率最高。但是進一步減少體積比產率下降明顯，這可能由于體系內的溴化氫濃度越來越高，而高濃度的溴化氫溶液不利于反應的進行。正交實驗選取體積比1∶2、1∶3、1∶4三個水平。

圖9 體積比對產率的影響Fig.9 Effect of the volume ratio on the yield

2.4 產物C的微波合成方法單因素實驗結果

2.4.1 微波功率對產率的影響 由圖10可知，提高功率產率增加，當增加到500W達到最高產率，功率過大產率反而下降。正交實驗選取微波功率500、600、700W三個水平。

圖10 微波功率對產率的影響Fig.10 Effect of microwave power on the yield

2.4.2 反應時間對產率的影響 由圖11可知，增加反應時間產率提高，30min達到最高產率，反應時間過長產率反而有所下降，但是下降并不明顯。正交實驗選取反應時間30、40、50min三個水平。

圖11 反應時間對產率的影響Fig.11 Effect of reaction time on the yield

2.4.3 反應溫度對產率的影響 由圖12可知，增加反應溫度，產率增加，當溫度增加至35℃時，達到最高產率，溫度過高產率反而降低。原因可能在于溫度過高影響了催化劑活性，從而使得產率下降。正交實驗選取反應溫度30、35、40℃三個水平。

圖12 反應溫度對產率的影響Fig.12 Effect of reaction temperature on the yield

圖13 摩爾數(shù)對產率的影響Fig.13 Effect of mole number on the yield

2.4.4 2 ，6-二甲基吡啶與產物B摩爾比對產率的影響 由圖13可知，增加摩爾比，產率增加，當增加至1∶1時，產率達到最大，比例過大產率反而降低。原因可能在于，此反應2，6-二甲基吡啶在體系中不但起到催化作用，同時還調節(jié)體系pH，隨著量的增多易發(fā)生催化劑中毒，且pH過大影響了催化劑活性，導致反應產率降低。正交實驗選取2，6-二甲基吡啶與產物B摩爾比1∶1、5∶4、3∶2三個水平。

2.5 正交實驗

產物A采用單因素實驗中的較優(yōu)條件：微波功率800W、反應時間20min、反應溫度70℃、甘露糖與乙酸酐摩爾比1∶11，進行多次驗證實驗后得產率平均為98.0%。根據(jù)單因素實驗結果，產物B按表1所示的因素水平進行正交實驗，結果見表3，通過因素分析及考察指標之間關系的分析，可知影響產物B產率4個因素對產率影響次序分別為D＞A＞C＞B，即體積比＞微波功率＞反應溫度＞反應時間。合成產率最高的組合為A2B3C2D2，即微波功率400W、反應時間50min、反應溫度25℃、乙酸酐與溴化氫乙酸溶液體積比1∶3。經驗證此條件下合成產率平均值為98.1%。

表3 產物B正交實驗結果Table 3 Orthogonal test and results of product B

從表4的方差分析可以得出，微波功率及乙酸酐與溴化氫乙酸溶液體積比對產率影響極為顯著（p＜0.01），反應溫度對產率影響顯著（p＜0.05），反應時間對產率影響不顯著。

表4 產物B方差分析結果Table 4 Orthogonal test analysis of variance table of product B

產物C按表2所示的因素水平進行正交實驗，結果見表5，通過因素分析及考察指標之間關系的分析，可知影響產物C產率4個因素對產率影響次序分別為A＞B＞D＞C，即微波功率＞反應時間＞摩爾比＞反應溫度。合成產率最高的組合為A1B2C1D1，即微波功率500W、反應時間40min、反應溫度30℃、2，6-二甲基吡啶與產物B摩爾比1∶1。驗證此條件下合成產率平均值為97.3%。

表5 產物C正交實驗結果Table 5 Orthogonal test and results of product C

從表6的方差分析可以得出，微波功率對產率影響極為顯著（p＜0.01），反應時間、2，6-二甲基吡啶與產物B摩爾比對產率影響顯著（p＜0.05），反應溫度對產率影響不顯著。

表6 產物C方差分析結果Table 6 Orthogonal test analysis of variance table of product C

3 結論

通過改變投料比例、反應物濃度、反應溫度、催化劑種類以及滴加速度等手段，對已有合成方法的工藝改進，所得產物產率均得到5%以上的提高，簡便了后續(xù)純化過程，為產物的大量合成進行了有效的探索。

首次將微波輔助技術應用于這三種重要的甘露糖衍生物合成中，減少了有毒試劑的使用，實驗發(fā)現(xiàn)三種產物的產率均得到提高，尤其減少了一些副產物的產生，簡便了柱純化過程，同時大幅減少了反應時間，三個產物的反應速度是傳統(tǒng)反應速度的5、11、14倍，產率分別提高5.7%、6.3%、11.5%?？梢?，與傳統(tǒng)方法相比，微波輔助法是一種綠色、高產、快速、簡便的合成方法。

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