紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變選育高產(chǎn)多糖羅耳阿太菌

李鴻梅，苗琇巖，魏 明，趙 慧，閔偉紅

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118）

羅耳阿太菌（Athelia rolfsii）屬半知菌亞門小菌核屬，有性世代為齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）[1-2]。該菌所分泌的多糖具有優(yōu)良的增稠性[3]、假塑性[4]、抗菌性[5]、抗腫瘤活性、免疫活性[6]，廣泛應(yīng)用于食品[7]、藥品、陶瓷、石油等領(lǐng)域[8]。目前，德國Cargill公司、美國Pillshury公司已有小菌核屬多糖工業(yè)化產(chǎn)品，而我國對該多糖的需求主要依賴進(jìn)口，主要原因是缺乏高產(chǎn)多糖的優(yōu)良菌株。

誘變是改良菌種的基本方法。常用誘變方法包括物理誘變（如紫外線、X射線、γ射線、快中子）和化學(xué)誘變（如堿基類似物誘變劑、移碼突變劑、烷化劑等）[9]。由于單獨(dú)使用一種誘變方法，誘變效率低，且易發(fā)生回復(fù)突變。目前國內(nèi)外學(xué)者通常采用紫外線或亞硝基胍誘變方法改良真菌菌種[10]。1976年，小菌核屬多糖由法國CECA S.E.公司商業(yè)化，商品名為Biopolymer CS，隨后法國賽諾菲生物公司收購了CECA S.E.公司，成為國際上生產(chǎn)小菌核屬多糖的主要生產(chǎn)者，并為該種多糖取商業(yè)名為Polytran[11]。目前我國還沒有該多糖的工業(yè)化產(chǎn)品，而且缺乏對羅耳阿太菌及其相近菌屬的菌種改良研究工作。本文通過響應(yīng)面設(shè)計紫外線（UV）和亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變羅耳阿太菌，根據(jù)目標(biāo)致死率優(yōu)化誘變條件，獲得高產(chǎn)多糖的正向突變菌株，提高多糖產(chǎn)量[12]，為該多糖在國內(nèi)的工業(yè)化生產(chǎn)奠定一定的科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅耳阿太菌（Sclerotium rolfsii） 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵實驗室保藏菌種；亞硝基胍（NTG）溶液 稱取10mg亞硝基胍于棕色瓶中，加1.0mL丙酮使其溶解，溶解后加10mL水，配制成1.0mg/mL亞硝基胍溶液[12-13]；PBS溶液 稱7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4、1.8g K2HPO4，溶于800mL蒸餾水中，用HCl調(diào)pH至7.4，用蒸餾水定容至1L，保存于4℃冰箱中備用；PDA斜面培養(yǎng)基（g/L） 馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂20，pH自然；種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖30.0、NaNO33.0、KH2PO41.0、酵母浸粉1.0、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5，pH4.0；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖35.0、NaNO33.0、KH2PO41.0、酵母浸粉1.0、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、檸檬酸1.4，pH4.5。

HZC-Q空氣浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)技術(shù)開發(fā)有限公司；HPX-9082 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；pH計 上海雷茲儀器廠；高速低溫離心機(jī)Z-36HK 德國HERMLE；HH-8水浴鍋 國華電器有限公司；MP6001電子天平 上海恒平有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種選育程序 出發(fā)菌株→制備菌絲體懸液→稀釋→誘變處理→涂平板→挑取單菌落斜面培養(yǎng)→搖瓶復(fù)篩→測定多糖產(chǎn)量。

1.2.2 培養(yǎng)條件 菌種斜面活化：29℃培養(yǎng)3d。種子搖瓶培養(yǎng)：100mL種子液，29℃，200r/min，2d。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)：100mL發(fā)酵液，接種量7%，29℃，200r/min，5.5d。

1.2.3 多糖提取 向培養(yǎng)結(jié)束的液體培養(yǎng)基中加3倍體積蒸餾水，用1mol/L NaOH調(diào)pH為7.0，80℃水浴處理40min，8000r/min離心30min，取300mL上清液，加入等體積95%乙醇，4℃靜置醇沉8h，5000r/min離心20min，取沉淀80℃烘干至恒重，稱量。

1.2.4 誘變方法

1.2.4.1 紫外誘變 將斜面培養(yǎng)基保存的菌種接種到種子培養(yǎng)液中，29℃下培養(yǎng)24h，勻漿，稀釋至10-3，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，在15W紫外燈下20cm處照射30s（紫外燈預(yù)熱30min），取0.1mL菌液涂平板。將平板置于29℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3d，計算致死率：

式中，S1—誘變處理前菌落面積；S2—誘變處理后菌落面積。

按上述方法固定其他因素，選擇紫外照射時間為20、30、40、50、60、70s，菌液稀釋梯度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，培養(yǎng)時間為12、18、24、30、36h，分別進(jìn)行單因素實驗。在突變株中選取7個長勢較好的菌株，分別命名UV1、UV2、UV3、UV4、UV5、UV6、UV7，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，提取并測定多糖產(chǎn)量。

1.2.4.2 亞硝基胍（NTG）誘變 將斜面培養(yǎng)基保存的菌種接種到種子培養(yǎng)液中，29℃培養(yǎng)24h，8000r/min離心10min，收集菌絲體，用PBS沖洗1次，加入0.5mL PBS制成菌絲體懸液，加入0.4mg/mL NTG溶液0.5mL，29℃處理40min后離心，用PBS沖洗菌絲體沉淀3次，除去殘留的NTG，轉(zhuǎn)移至100mL種子培養(yǎng)基中29℃培養(yǎng)2d，勻漿振蕩2min，稀釋10-3，涂平板，29℃培養(yǎng)3d，計算致死率。

按上述方法固定其他因素，選擇亞硝基胍濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/mL，誘變時間10、20、30、40、50、60min，分別進(jìn)行單因素實驗。根據(jù)單因素實驗結(jié)果選擇亞硝基胍誘變條件為：亞硝基胍濃度0.4mg/mL，亞硝基胍處理時間40min，進(jìn)行亞硝基胍誘變。在突變株中選取7個長勢較好的菌株，分別命名為NTG1、NTG2、NTG3、NTG4、NTG5、NTG6、NTG7，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，提取并測定多糖產(chǎn)量。

1.2.4.3 紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變 將斜面培養(yǎng)基保存的菌種接種到種子培養(yǎng)液中，29℃培養(yǎng)24h，勻漿，稀釋10-3。15W紫外燈下20cm處照射菌絲體懸浮液一段時間（響應(yīng)面設(shè)計），8000r/min離心10min，收集菌絲體，用PBS沖洗1次，加入0.5mL PBS制成菌絲體懸液，加入一定濃度的NTG（響應(yīng)面設(shè)計），浸泡紫外誘變后的菌絲體，29℃誘變處理一段時間（響應(yīng)面設(shè)計）后離心，離心后用PBS沖洗菌絲體沉淀3次，除去殘留的NTG，轉(zhuǎn)移菌絲體至100mL種子培養(yǎng)基中，29℃下培養(yǎng)2d，勻漿，稀釋10-3，涂平板，29℃培養(yǎng)3d，計算致死率。從平板上隨機(jī)選取16個長勢較好的菌株，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，提取并測定多糖產(chǎn)量。

1.2.4.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計復(fù)合誘變 紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變響應(yīng)面設(shè)計因素見表1。

表1 紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變響應(yīng)面因素表Table 1 Response surface factors and levels on UV and NTG mutagenize

1.2.5 遺傳穩(wěn)定性實驗 選取誘變后得到的多糖產(chǎn)量較高的變異菌株連續(xù)傳代5次，每代分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，提取并測定多糖產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外（UV）誘變

2.1.1 紫外照射時間對致死率的影響 按1.2.4.1采用不同的照射時間對菌體進(jìn)行處理，以未經(jīng)紫外照射的菌株為對照，計算致死率，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨照射時間的延長，致死率逐漸增加。較高的誘變指標(biāo)（致死率）有利于篩選優(yōu)良菌株，但由于紫外線有殺菌的效果，如果處理時間過長，一些高活性菌株也可能致死，不利于篩選。因此，選擇70%～80%為目的致死率。從圖1中可看出當(dāng)處理時間為50s時，致死率達(dá)71.65%，因此選取50s為紫外照射時間。

圖1 照射時間對UV誘變致死率的影響Fig.1 Effect of UV radiation time on lethality rate

2.1.2 菌液稀釋梯度對致死率的影響 稀釋梯度對致死率的影響見圖2，從圖2中可以明顯看出，菌液稀釋梯度對致死率影響較大。當(dāng)稀釋梯度為10-1時，紫外誘變致死率較低，僅為17.32%，這可能是由于菌絲體密度過大影響了紫外線的穿透能力，使誘變效果不明顯；隨著菌液濃度的增大，紫外線的穿透能力隨之增強(qiáng)，菌種致死率明顯增加。但是菌液濃度過低時，菌絲體含量較少，紫外線穿透量過大，紫外照射會殺死大量菌體，所以當(dāng)稀釋梯度為10-5時，致死率接近100%。稀釋梯度為10-3時，致死率為68.32%，接近目標(biāo)致死率。因此，稀釋梯度選擇為10-3。

圖2 菌液稀釋梯度對UV誘變致死率的影響Fig.2 Effect of diluted Athelia rolfsii liquid gradient on lethality rate by UV

2.1.3 種子培養(yǎng)基培養(yǎng)時間對致死率的影響 選擇種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間的菌種進(jìn)行紫外誘變，致死率結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出，在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h時的菌種經(jīng)紫外照射后，在平板培養(yǎng)基中基本沒有菌落出現(xiàn)，這可能是由于經(jīng)過12h的培養(yǎng)，菌種生長還停留在適應(yīng)期，紫外照射引起成大量菌種死亡；而經(jīng)過種子培養(yǎng)基培養(yǎng)36h的菌種，紫外誘變后致死率僅為34.79%，可能是由于菌體生長處于對數(shù)期末期或穩(wěn)定期，此期間菌體生長狀況基本穩(wěn)定，紫外照射誘變后的菌種致死率較低。培養(yǎng)24h的菌種經(jīng)紫外誘變后致死率為74.68%，符合目的致死率。因此，選擇培養(yǎng)24h的菌種進(jìn)行紫外誘變處理。

圖3 種子培養(yǎng)時間對UV誘變致死率的影響Fig.3 Effect of Athelia rolfsii incubation time in seed culture medium on lethality rate by UV

2.1.4 紫外誘變對多糖產(chǎn)量的影響 紫外誘變對多糖產(chǎn)量的影響如圖4所示，采用單因素實驗獲得的最佳條件（紫外照射時間50s、稀釋梯度10-3、培養(yǎng)時間24h）對羅耳阿太菌進(jìn)行紫外誘變，突變株多糖產(chǎn)量有明顯變化。正向突變株多糖產(chǎn)量明顯增加，其中UV1、UV2、UV6和UV7多糖產(chǎn)量相對出發(fā)菌株增長率均高于10%。UV7多糖產(chǎn)量最高，達(dá)17.759g/L，比出發(fā)菌株16.042g/L增長了10.70%。

圖4 紫外誘變菌株的多糖產(chǎn)量Fig.4 Polysaccharide production from different mutant strains treated by UV

2.2 亞硝基胍誘變

2.2.1 亞硝基胍濃度對致死率的影響 亞硝基胍是有效的化學(xué)誘變劑，可以使DNA分子上的堿基及磷酸部分烷化，導(dǎo)致DNA復(fù)制時堿基配對錯誤而引起突變。不同濃度亞硝基胍誘變菌體所得致死率結(jié)果見圖5，亞硝基胍濃度為0.1mg/mL時，致死率僅為13.16%。隨著亞硝基胍濃度的增加，致死率明顯升高，當(dāng)亞硝基胍濃度達(dá)到0.4mg/mL時，致死率為71.35%，在目標(biāo)致死范圍之內(nèi)。繼續(xù)提高亞硝基胍濃度，菌體致死率迅速提高，濃度為0.6mg/mL時，菌體基本完全死亡。所以在亞硝基胍誘變中選擇亞硝基胍濃度為0.4mg/mL。

圖5 亞硝基胍濃度對致死率的影響Fig.5 Effect of NTG concentration on lethality rate

圖6 亞硝基胍處理時間對致死率的影響Fig.6 Effect of treated time by NTG on lethality rate

2.2.2 亞硝基胍處理時間對致死率的影響 一般來說，延長亞硝基胍的處理時間，會增大菌體DNA突變的幾率，從而提高致死率。真菌誘變致死率一般要求控制在70%～80%之間，為了獲得這樣高的致死率，通常控制亞硝基胍的處理時間在20～70min之間。亞硝基胍誘變時間對菌體致死率的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，亞硝基胍處理10min，菌體的致死率為26.32%；隨著誘變時間的增加，菌體致死率顯著提高。誘變時間為40min時，致死率達(dá)到79.65%，在目標(biāo)致死范圍之內(nèi)。誘變時間為60min時，菌體基本死亡。因此在亞硝基胍誘變中處理時間選擇40min。

2.2.3 亞硝基胍誘變對多糖產(chǎn)量的影響 亞硝基胍誘變對多糖產(chǎn)量的影響如圖7所示，采用單因素實驗獲得的最佳條件（亞硝基胍濃度0.4mg/mL，亞硝基胍處理時間40min）對羅耳阿太菌進(jìn)行亞硝基胍誘變，突變株多糖產(chǎn)量有明顯變化。正向突變株多糖產(chǎn)量明顯增加，其中NTG1、NTG2、NTG5和NTG7多糖產(chǎn)量相對于出發(fā)菌株增長率均高于14%。其中NTG7多糖產(chǎn)量最高，達(dá)18.573g/L，比出發(fā)菌株16.042g/L增長了15.78%。

圖7 亞硝基胍誘變突變株的多糖產(chǎn)量Fig.7 Polysaccharide production from different mutant strains treated by NTG

2.3 紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變

2.3.1 復(fù)合誘變條件 根據(jù)表1進(jìn)行紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變，實驗結(jié)果見表2，響應(yīng)面結(jié)果分析、回歸模型參數(shù)方差分析見表3。

以致死率為響應(yīng)值回歸擬合所得各因素函數(shù)表達(dá)如下：Y=79.20+4.40A+13.35B+4.03C-7.03AB-0.23AC-3.32BC-0.63A2-1.64B2+3.62C2。

由方差分析得出p值，模型極顯著，模型的失擬性不顯著，回歸決定系數(shù)R2=0.9897，修正決定系數(shù)R2Adj=0.9764，說明方程擬合性較好，可對培養(yǎng)條件分析預(yù)測。采用Design Expert 8.0.5對結(jié)果分析，目標(biāo)致死率選擇75%，確定復(fù)合條件見表4。

2.3.2 復(fù)合誘變對多糖產(chǎn)量的影響 按表4中修正條件對羅耳阿太菌進(jìn)行復(fù)合誘變，突變株多糖產(chǎn)量如圖8所示，每組選取四株長勢較好的突變株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，都能篩選出正向突變菌株，其中X2、X3、X13菌株的多糖產(chǎn)量均達(dá)到19g/L以上。紫外照射40s，濃度為0.28mg/mL的亞硝基胍處理25min的突變菌株X2多糖產(chǎn)量最高，達(dá)19.868g/L，比出發(fā)菌株16.042g/L增長了23.85%。

2.4 遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果

將圖8中X2突變株連續(xù)傳代培養(yǎng)5次，發(fā)酵測定多糖產(chǎn)量，多糖產(chǎn)量遺傳穩(wěn)定性結(jié)果見表5。由表5可知，在幾次傳代中，多糖產(chǎn)量基本相同，均達(dá)到19.6g/L以上。對傳代5次的多糖產(chǎn)量進(jìn)行方差分析，計算方差為0.001，表明經(jīng)過傳代后的X2菌株多糖產(chǎn)量基本穩(wěn)定。實驗結(jié)果表明X2菌株產(chǎn)多糖的遺傳穩(wěn)定性較好。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Process variables and levels of UV and NTG in response surface central composite design and experimental results

表3 復(fù)合誘變回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for regression model of composite mutation

圖8 紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變菌株多糖產(chǎn)量Fig.8 Polysaccharide production from different mutanted strains treated by UV and NTG

表4 優(yōu)化復(fù)合誘變條件Table 4 Variance analysis for regression model of composite mutation

表5 突變菌株X2產(chǎn)多糖遺傳穩(wěn)定性Table 5 Stablity of polysaccharide production from X2

3 結(jié)論

分別采用紫外線和亞硝基胍誘變羅耳阿太菌，UV7突變株多糖產(chǎn)量為17.759g/L，NTG7突變株多糖產(chǎn)量為18.573g/L。紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變條件為：紫外照射40s，亞硝基胍濃度0.28mg/mL，亞硝基胍處理時間25min，篩選得到X2突變株，多糖產(chǎn)量最高為19.868g/L，比出發(fā)菌株16.042g/L增長了23.85%。以X2為出發(fā)菌株，連續(xù)傳代5次，多糖產(chǎn)量基本一致，表明通過亞硝基胍與紫外復(fù)合誘變得到的X2菌株遺傳穩(wěn)定性較好。

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