糖基化終末產(chǎn)物對(duì)體外培養(yǎng)牛眼小梁細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響

張敏 王強(qiáng) 王康

糖基化終末產(chǎn)物對(duì)體外培養(yǎng)牛眼小梁細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響

張敏 王強(qiáng) 王康

小梁細(xì)胞；糖基化終末產(chǎn)物；活性氧；原發(fā)性開(kāi)角型青光眼；細(xì)胞凋亡

目的通過(guò)觀察糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE)對(duì)體外培養(yǎng)牛眼小梁細(xì)胞凋亡的影響，研究AGE與原發(fā)性開(kāi)角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討其發(fā)病機(jī)制。方法體外培養(yǎng)牛眼小梁細(xì)胞，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和神經(jīng)元特異性烯醇化酶染色對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將第3代小梁細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，在培養(yǎng)基中加入不同濃度(0 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1)的AGE-BSA培養(yǎng)96 h。終濃度(200 μg·mL-1)的AGE-BSA培養(yǎng)液處理細(xì)胞不同時(shí)間(48 h、72 h、96h)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小梁細(xì)胞凋亡率；活性氧熒光探針2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。結(jié)果50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1AGE-BSA作用96 h后細(xì)胞凋亡率分別為(5.60±0.25)%、(9.57±0.08)%、(17.68±0.21)%，與對(duì)照組(0 μg·mL-1AGE-BSA)細(xì)胞凋亡率(4.45±0.12)%相比均明顯增高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；200 μg·mL-1AGE-BSA作用細(xì)胞48 h、72 h、96 h后凋亡率分別為(10.51±0.28)%、(13.47±0.42)%、(17.68±0.21)%，與對(duì)照組相比也均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與對(duì)照組比較，AGE-BSA 處理后細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BSA 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論在體外培養(yǎng)的條件下，AGE可能通過(guò)刺激牛眼小梁細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS介導(dǎo)小梁細(xì)胞凋亡。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(7):640-642，646]

原發(fā)性開(kāi)角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是一種常見(jiàn)致盲性眼病,大型流行病學(xué)研究顯示糖尿病為POAG最常見(jiàn)的病因，與POAG發(fā)病率呈正相關(guān)[1]。糖尿病患者中POAG的發(fā)病率為4%～11%[2],比一般人群(2%)高。糖尿病與POAG間的關(guān)系密切，但糖尿病患者并發(fā)POAG的發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究表明糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE)是糖尿病眼部并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要影響因素[3-4]。本研究通過(guò)研究不同濃度AGE對(duì)體外培養(yǎng)牛眼小梁細(xì)胞凋亡的影響,進(jìn)一步探討糖尿病患者中青光眼發(fā)病率較正常人高的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1眼球1歲左右公牛新鮮眼球8只，取自本地屠宰場(chǎng)，4 ℃冰桶運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Hepes及胰蛋白酶均購(gòu)自Hyclone生物化學(xué)制品有限公司，兔抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)單克隆抗體一抗、羊抗兔FITC-IgG二抗均購(gòu)自博士德公司，AGE-牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(10 mg·mL-1)購(gòu)自Calbiochem公司，BSA購(gòu)自Biovision公司，2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2’,7’ -dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)購(gòu)自Sigma公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1牛眼小梁細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞鑒定采用本實(shí)驗(yàn)室既往方法[5-6]，取新鮮牛眼球，常規(guī)消毒后，截取距角鞏膜緣后5 mm的組織，剔除晶狀體及其后組織，暴露虹膜。解剖顯微鏡下，小心去除虹膜組織，用顯微鑷輕輕撕取鞏膜突和Schawlbe線中間的白色疏松小梁網(wǎng)組織，移入10 cm培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)箱靜置0.5 h。組織塊貼壁后，加入12 mL DMEM高糖培養(yǎng)基(含150 g·L-1胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100×103U·L-1)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每4 d更換一次培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)特征。用2.5 g·L-1胰蛋白酶含0.2 g·L-1EDTA消化傳代。取傳二代小梁細(xì)胞接種于預(yù)置蓋玻片的培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞接近融合期時(shí)，用0.01 mol·L-1PBS(pH=7.2)緩沖液沖洗，40 g·L-1多聚甲醛溶液固定，室溫干燥。免疫熒光法行NSE染色(兔抗人NSE單克隆抗體一抗，羊抗兔FITC-IgG二抗)，共聚焦顯微鏡下觀察鑒定小梁細(xì)胞的組織來(lái)源。

1.2.2AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率將第3代小梁細(xì)胞以每孔100×103個(gè)的密度接種于6孔板。經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h達(dá)細(xì)胞同步化后，將其分為6組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。任意取其中4組，培養(yǎng)基中加入不同濃度(0 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1)的AGE-BSA培養(yǎng)細(xì)胞96 h，剩余2組培養(yǎng)基中加入200 μg·mL-1的AGE-BSA分別培養(yǎng)細(xì)胞48 h、72 h。不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞后收集于流式管中，制成單細(xì)胞懸液。4 ℃下離心(2000 r·min-1,5 min)2次。500 μL緩沖液重懸細(xì)胞。加入Annexin V-FIT C、PI各5 μL，混勻后避光孵育15 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)采用活性氧(ROS)特異熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。將傳3代小梁細(xì)胞以每孔100×103個(gè)的密度接種于6個(gè)孔板，細(xì)胞貼壁后將其分為4組，每組設(shè)6復(fù)孔。在培養(yǎng)基中加入不同濃度(0、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1)的AGE-BSA培養(yǎng)細(xì)胞96 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適量稀釋好的10 μmol·L-1DCFH-DA溶液，37℃避光孵育20 min。用無(wú)血清培養(yǎng)基充分洗去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液,收集于流式管中。30 min內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組DCF熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1體外培養(yǎng)的小梁細(xì)胞形態(tài)觀察、鑒定倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)5～10 d小梁細(xì)胞開(kāi)始圍繞組織塊貼壁向外生長(zhǎng)。細(xì)胞形態(tài)多樣化，呈梭形、不規(guī)則多邊形等，有突起和分支(圖1A)。13 d左右組織塊周?chē)尚纬蓡渭?xì)胞層。取3代細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞NSE染色陽(yáng)性(圖1B)證明小梁細(xì)胞為神經(jīng)外胚層神經(jīng)嵴間充質(zhì)來(lái)源,確認(rèn)所培養(yǎng)細(xì)胞為小梁細(xì)胞。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AGE-BSA對(duì)小梁細(xì)胞凋亡的影響50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1AGE-BSA作用96 h后細(xì)胞凋亡率分別為(5.60±0.25)%、(9.57±0.08)%、(17.68±0.21)%，與對(duì)照組(0 μg·mL-1AGE-BSA)細(xì)胞凋亡率(4.45±0.12)%相比均明顯增高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，提示AGE-BSA可誘導(dǎo)小梁細(xì)胞凋亡，且凋亡率在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性增加。200 μg·mL-1AGE-BSA作用細(xì)胞48 h、72 h、96 h后凋亡率分別為(10.51±0.28)%、(13.47±0.42)%、(17.68±0.21)%，與對(duì)照組相比也均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，提示AGE-BSA誘導(dǎo)小梁細(xì)胞凋亡在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間依賴性增加。BSA 對(duì)照組與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖2)。

Figure 1 Identification of cultured bovine trabecular meshwork cells.A:Primary cultured bovine trabecular meshwork cells for 8 days with rhomboid or polygonal appearence(×400);B:Positive staining of neuron-specific enolase under inverted fluorescent microscope(×400) 培養(yǎng)的牛眼小梁細(xì)胞的鑒定。A:原代培養(yǎng)8 d的小梁細(xì)胞呈梭形、多邊形(×400)；B:熒光倒置顯微鏡觀察傳代的細(xì)胞NSE染色陽(yáng)性(×400)

Figure 2 Effects of different concentrations,treatment time and pre-treatment of AGE-BSA on apoptosis of cultured bovine trabecular meshwork cells.A:Normal control group;B:50 μg·mL-1 AGE-BSA group;C:100 μg·mL-1 AGE-BSA group;D:200 μg·mL-1 AGE-BSA for 48 hours group;E:200 μg·mL-1 AGE-BSA for 72 hours group;F:200 μg·mL-1 AGE-BSA for 96 hours group;G:BSA control group 不同濃度AGE-BSA作用不同時(shí)間和不同預(yù)處理對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響。A:正常對(duì)照組;B:50 μg·mL-1 AGE-BSA 組;C:100 μg·mL-1 AGE-BSA 組;D:200 μg·mL-1 AGE-BSA 48 h組;E:200 μg·mL-1 AGE-BSA 72 h 組;F:200 μg·mL-1 AGE-BSA 96 h組;G:BSA 對(duì)照組

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AGE-BSA對(duì)小梁細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響ROS特異熒光探針DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，但可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被酯酶水解生成DCFH。無(wú)熒光的DCFH可以被ROS氧化生成有熒光的DCF，檢測(cè)DCF 的熒光強(qiáng)度可反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。與對(duì)照組比較，AGE-BSA 處理后細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BSA 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖3)。

3 討論

POAG是一種常見(jiàn)的致盲性眼病，眼壓升高是其主要病理特征。房水排出通道的病理改變可以引起眼壓升高。作為房水流出的主要通道小梁網(wǎng)在調(diào)節(jié)房水外流及控制眼壓方面發(fā)揮重要作用。氧化應(yīng)激可通過(guò)損傷小梁網(wǎng)而導(dǎo)致眼壓升高[7-8]。

循環(huán)血中沉積在眼部的AGE以及眼組織中的長(zhǎng)壽蛋白糖化形成的AGE與其受體相互作用,導(dǎo)致了糖尿病和年齡相關(guān)性眼病[3]。在培養(yǎng)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞中，AGE呈時(shí)間和劑量依賴性促進(jìn)ROS 的產(chǎn)生，ROS被證實(shí)是AGE 致病的重要中間介導(dǎo)因子[9]，其引起的氧化應(yīng)激是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要觸發(fā)因素[10]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AGE-BSA可以明顯提高小梁細(xì)胞內(nèi)ROS水平，同時(shí)小梁細(xì)胞的凋亡率隨AGE-BSA濃度的增大以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。我們推測(cè)AGE-BSA可能是通過(guò)誘導(dǎo)小梁細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS引起氧化應(yīng)激并通過(guò)某些途徑導(dǎo)致小梁細(xì)胞凋亡。小梁網(wǎng)主要由小梁柱以及內(nèi)襯的小梁細(xì)胞組成，小梁細(xì)胞具有吞噬、收縮、合成和分泌等功能，其數(shù)量的異常減少是POAG最重要的病理改變之一,與它的發(fā)病密切相關(guān)[11]。在小梁細(xì)胞，氧化應(yīng)激還可以激活NF-κB通路，促進(jìn)MMPs/TIMPs的表達(dá),調(diào)節(jié)小梁細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的重塑，持續(xù)的氧化應(yīng)激可以引起小梁細(xì)胞功能失代償，導(dǎo)致小梁網(wǎng)處ECM 沉積[12]。據(jù)此我們推測(cè)，AGE引起的持續(xù)氧化應(yīng)激一方面可能通過(guò)誘導(dǎo)小梁細(xì)胞凋亡，使小梁細(xì)胞數(shù)目隨AGE濃度的增高而減少，導(dǎo)致小梁網(wǎng)的正常功能難以維持，另一方面激活小梁

Figure 3 Effects of AGE-BSA on ROS level in trabecular meshwork cells AGE-BSA對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響

網(wǎng)細(xì)胞NF-κB通路，破壞MMPs/TIMPs的表達(dá)平衡，進(jìn)而促進(jìn)小梁網(wǎng)處ECM沉積。這兩方面最終導(dǎo)致房水流出受阻，引發(fā)POAG。本研究從一個(gè)側(cè)面解釋了糖尿病患者易并發(fā)POAG的機(jī)制并對(duì)指導(dǎo)糖尿病并發(fā)POAG患者的臨床用藥提供了一定理論依據(jù)。

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date:Jul 28,2013

Effects of advanced glycation end products on oxidative stress and apoptosis of bovine trabecular meshwork cells cultured in vitro

ZHANG Min,WANG Qiang,WANG Kang

trabecular meshwork cell;advanced glycation end products;reactive oxygen species;primary open angle glaucoma;apoptosis

ObjectiveTo investigate the effects of advanced glycation end products (AGE) on apoptosis of bovine trabecular meshwork cells (TM cells) culturedinvitro,and further explore the relationship between AGE and primary open angle glaucoma (POAG),probe its pathogenesis.MethodsThe bovine TM cells were culturedinvitroand identified by morphological evaluation and neuronspecific enolase staining.The third generation of cells were inoculated to 6-well plate,and different concentrations(0 μg·mL-1,50 μg·mL-1,100 μg·mL-1and 200 μg·mL-1)AGE-BSA was added into the medium for 96 hours,or treated with AGE-BSA (200 μg·mL-1) for different time (48 hours,72 hours and 96 hours).Flow cytometry was performed to detect the cells apoptosis,and the level of reactive oxygen species (ROS) was evaluated by 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) method.ResultsThe apoptotic rates after treating with different concentrations (50 μg·mL-1,100 μg·mL-1and 200 μg·mL-1) AGE-BSA for 96 hours were (5.60±0.25)%,(9.57±0.08)% and (17.68±0.21)%,respectively,which were obviously higher than the control group(4.45±0.12)% (allP<0.05).The apoptotic rates after treating with 200 μg·mL-1AGEs-BSA for 48 hours,72 hours and 96 hours were (10.51±0.28)%,(13.47±0.42)% and (17.68±0.21)%,respectively,which were also obviously higher than the control group (allP<0.05).Compared with control group,the ROS level in bovine TM cells after treating with AGE-BSA was increased (P<0.05),but there was no statistical difference after treating with BSA (P>0.05).ConclusionAGE can increase the ROS level in bovine TM cells culturedinvitroto mediate their apoptosis.

張敏，女，1986年9月出生，山東濰坊人，在讀碩士研究生。研究方向:青光眼。聯(lián)系電話:15684203717；E-mail:bzyxyzm2008@126.com

AboutZHANGMin:Female，born in September,1986.Postgraduate students.Tel:15684203717;E-mail:bzyxyzm2008@126.com

2013-07-28

264003 山東省煙臺(tái)市，濱州醫(yī)學(xué)院(張敏)；256603 山東省濱州市，濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院(王強(qiáng)，王康)

王強(qiáng)，E-mail:bywq001@126.com

張敏，王強(qiáng)，王康．糖基化終末產(chǎn)物對(duì)體外培養(yǎng)牛眼小梁細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響[J]．眼科新進(jìn)展，2014，34(7)：640?642，646．

10．13389/j．cnki．rao．2014．0175

【實(shí)驗(yàn)研究】

修回日期:2013-11-12

本文編輯:周志新

Accepteddate:Nov 12,2013

From theBinzhouMedicalUniversity(ZHANG Min),Yantai264003,ShandongProvince,China;AffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity(WANG Qiang,WANG Kang),Binzhou256603,ShandongProvince,China

Responsibleauthor:WANG Qiang，E-mail:bywq001@126.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(7):640-642，646]