硫氧還蛋白TXN對視神經(jīng)軸突損傷的保護作用

劉曉文 付汛安

硫氧還蛋白TXN對視神經(jīng)軸突損傷的保護作用

劉曉文 付汛安

硫氧還蛋白；軸突形成；軸突保護；視神經(jīng)

目的研究硫氧還蛋白(thioredoxin,TXN)在視神經(jīng)軸突保護中的作用，為視神經(jīng)損傷提供有效的治療方案。方法制作大鼠視神經(jīng)夾傷模型，以正常大鼠作為正常對照組。按夾傷后處死時間不同，選取傷后1周、2周、4周三個時間點，提取實驗組和正常對照組中大鼠視網(wǎng)膜的mRNA和蛋白，通過RT-PCR和Western blot實驗方法檢測TXN表達情況；用曲古抑菌素A(TSA)刺激RGC-5細胞，觀察在TSA刺激后，RGC-5細胞的軸突形成情況，并檢測TXN表達量的變化。構(gòu)建TXN的真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染進RGC-5細胞，在TNF-α刺激條件下，觀察RGC-5細胞的軸突形成情況以及軸突長度的改變。結(jié)果與正常大鼠比較，視神經(jīng)夾傷模型大鼠中TXN的mRNA以及蛋白水平明顯下降。在傷后1周，TXN mRNA表達量僅下降了32%,而在傷后2周、4周則分別下降了55%以及70%，說明TXN表達水平的降低是隨著夾傷后時間的延長而增加的。用TSA誘導(dǎo)RGC-5細胞24 h，觀察到RGC-5細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，約65%的細胞分化產(chǎn)生軸突，而對照組(DMSO處理)中細胞沒有形成軸突，同時Western blot結(jié)果顯示，相對于DMSO處理，TSA刺激后TXN的表達明顯升高。在TNF-α刺激下，RGC-5細胞的軸突形成比率從(65±5)%減少至(30±4)%，軸突長度從(100±6)μm下降至(74±6)μm。而在過表達TXN情況下，TNF-α刺激RGC-5細胞，軸突形成比率為(52±7)%，軸突的長度為(92±8)μm，較未刺激細胞僅有較少的降低。結(jié)論在軸突發(fā)生損傷后，TXN的表達量顯著下降。而在軸突形成過程中，TXN的表達量明顯上升并且過表達TXN能很好地減輕外界刺激誘導(dǎo)的軸突損傷。TXN可能參與了軸突形成并且能有效地防止軸突的損傷。

[眼科新進展，2014，34(7):636-639]

視神經(jīng)是由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)的軸突組成,RGC的進行性死亡是視神經(jīng)損傷時導(dǎo)致視功能不可逆性損害的主要原因[1]。因此如何使視神經(jīng)功能恢復(fù)，從而能夠促進RGC的修復(fù)和再生是目前研究的熱點。但目前在臨床上，對視神經(jīng)損傷后軸突再生的治療還沒有既安全又有效、能夠推廣應(yīng)用的方法。硫氧還蛋白(thioredoxin，TXN)系統(tǒng)是一種普遍分布于各種生物、各個組織器官的氧化還原系統(tǒng)，由TXN、TXN還原酶(thioredoxin reduetase，TrxR)和還原型輔酶II(NADPH)共同組成[2-4]。近年來的研究證實，TXN系統(tǒng)廣泛參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)、細胞增殖與凋亡、炎癥應(yīng)答、個體發(fā)育等多種生物學(xué)過程[5-7]。本研究將檢測在軸突形成以及損傷過程中，TXN的表達情況，以及過表達TXN是否能有效保護軸突免受外界刺激導(dǎo)致的損傷，該研究將為視神經(jīng)的保護以及再生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組健康成年Wistar大鼠(清潔級)60只，購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，雌雄不限，室溫環(huán)境下飼養(yǎng)。按隨機數(shù)字表法分為正常對照組(30只)以及實驗組(30只)，在視神經(jīng)夾傷后1周、2周、4周分別處死10只正常大鼠和10只視神經(jīng)夾傷模型的大鼠，對動物的處理方法符合動物倫理學(xué)要求。

1.2RGC-5細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基為DMEM(Gibco)，培養(yǎng)細胞時加入體積分數(shù)10%的胎牛血清，購于Invitrogen公司。細胞培養(yǎng)箱設(shè)定溫度為37 ℃，CO2的含量為體積分數(shù)5%。

1.3實驗試劑TSA和TNF-α購于Sigma公司，TXN來源于多克隆抗體(12000，Epitomic公司)，RNA抽提試劑以及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Invitrogen公司；TXN的RT-PCR引物為F:5’-AGCTTGTGGTAGTGGACTTCTCTG-3’；R:5’-CACCAGAGAACTCCCCAACCT-3’。

1.4實驗方法

1.4.1構(gòu)建大鼠視神經(jīng)夾傷模型成年Wistar大鼠，用夾持力為148 g、端寬1 mm的小號動脈阻血鑷，在眼球后2 mm處夾傷左側(cè)視神經(jīng),致傷時間10 s，即可構(gòu)建出視神經(jīng)夾傷模型[8]。

1.4.2TXN真核表達質(zhì)粒構(gòu)建從武漢三鷹公司購得TXN基因的cDNA,通過EcoRⅠ和BamHⅠ將該cDNA接入到p3xFLAG-CMV-7.1質(zhì)粒中。

1.4.3RT-PCR實驗不同時間處死正常對照組以及實驗組大鼠，取視網(wǎng)膜組織，加入2 mL的Trizol溶液，研磨后轉(zhuǎn)入EP管中，室溫放置5 min，加0.4 mL的氯仿，放置2～3 min后，4 ℃12 000 r·min-1離心15 min，取上層水相置于新EP管中,加入1 mL的異丙醇，放置10 min,4 ℃12 000 r·min-1離心10 min，加1 mL體積分數(shù)75%乙醇進行洗滌后，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥，用30 μL的RNAase-free water 溶解RNA沉淀。測定抽提的RNA濃度，利用Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄2 μg總RNA，產(chǎn)生cDNA，用TXN特異性引物進行擴增。

1.4.4Westernblot實驗分別在正常對照組以及實驗組大鼠的視網(wǎng)膜組織中加入1 mL蛋白裂解液，研磨后轉(zhuǎn)入EP管，4 ℃12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，即為視網(wǎng)膜組織的總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將收集得到的正常對照組以及實驗組的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，PVDF膜用TXN抗體4 ℃孵育過夜后，用TBST溶液洗滌3次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌后，ECL顯影。

1.4.5RGC-5細胞處理在DMSO培養(yǎng)液中加入和不加入500 nmol·L-1的TSA來培養(yǎng)RGC-5細胞，24 h后觀察細胞形態(tài)的改變，并通過RT-PCR和Western blot的方法檢測TXN表達量的變化。軸突RGC-5細胞在用藥物刺激后，除去培養(yǎng)基，細胞固定后，用預(yù)熱的Hochest溶液孵育20 min，再換用含軸突特異性定位蛋白的抗體溫育1 h，用PBS清洗3次，每次5 min，加入 FITC標記的熒光二抗，孵育1 h。在熒光顯微鏡下計算細胞軸突產(chǎn)生的比例以及對軸突的長度進行測量。觀察多個視野后進行統(tǒng)計，細胞總數(shù)目應(yīng)大于200個[9]。在RGC-5細胞中分別轉(zhuǎn)染p3xFLAG-CMV-7.1或者p3xFLAG-CMV-7.1-TXN質(zhì)粒，培養(yǎng)12 h后，用500 nmol·L-1的TSA誘導(dǎo)24 h再分別用DMSO以及0.5 μg TNF-α刺激細胞4 h后，統(tǒng)計刺激后細胞軸突比率及長度的改變。

1.5數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析用Quantity One軟件對Western blot以及RT-PCR的結(jié)果進行灰度值計算，結(jié)果用Excel 7.0以及SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠視神經(jīng)夾傷后TXN的表達變化構(gòu)建大鼠的視神經(jīng)夾傷模型，取夾傷后1周、2周、4周3個時間點，分別提取正常大鼠以及視神經(jīng)夾傷大鼠的視網(wǎng)膜mRNA以及蛋白，利用RT-PCR以及Western blot檢測TXN的mRNA以及蛋白水平的變化。從RT-PCR結(jié)果來看，視神經(jīng)夾傷后，TXN mRNA水平明顯下降，并且隨著視神經(jīng)夾傷時間的延長，TXN mRNA下降更加明顯(圖1),對RT-PCR結(jié)果進行定量分析后發(fā)現(xiàn):在傷后1周，TXN mRNA只下降了32%,而在傷后2周、4周則分別下降了55%以及70%(圖1)。Western blot檢測視網(wǎng)膜組織中TXN蛋白的表達，結(jié)果顯示在視神經(jīng)夾傷后，TXN的蛋白水平亦出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)，并隨時間的延長而更明顯，結(jié)果與RT-PCR一致(圖1)。

2.2TSA誘導(dǎo)RGC-5細胞產(chǎn)生軸突并能顯著地增加TXN的表達我們用500 nmol·L-1的TSA誘導(dǎo)RGC-5細胞24 h后，發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的改變。在誘導(dǎo)前，RGC-5細胞表現(xiàn)為梭形，而在誘導(dǎo)后，細胞改變?yōu)樾切危a(chǎn)生與神經(jīng)元軸突類似的結(jié)構(gòu)(圖2)。該結(jié)果表明RGC-5細胞可以作為軸突形成以及損傷的細胞研究模型。為了研究TXN在軸突形成中的功能，我們用RT-PCR檢測在TSA誘導(dǎo)前后TXN mRNA水平的改變，對RT-PCR進行定量分析發(fā)現(xiàn):在TSA誘導(dǎo)后，TXN mRNA水平上升了2倍(圖2)。Western blot檢測TSA誘導(dǎo)后RGC-5細胞中TXN蛋白水平，結(jié)果亦顯示TXN蛋白在誘導(dǎo)后表達水平也顯著增高(圖2)。為了進一步研究TSA誘導(dǎo)時間對TXN表達量的影響，RGC-5細胞在誘導(dǎo)6 h、12 h、18 h、24 h后，分別檢測TXN mRNA水平，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時間的延長，TXN mRNA水平增加更加顯著，同時觀察到隨著誘導(dǎo)時間的延長，RGC-5細胞產(chǎn)生軸突的比例以及軸突的長度都有增長。該結(jié)果說明TXN可能參與了軸突的形成。

Figure 1 Expression of TXN at different time after ON injury.A:TXN mRNA level at different time after ON injury,the results showed that with the time of ON injury prolonged,TXN mRNA decreased more significantly;B:Histogram analysis of TXN mRNA level;C:TXN protein level at different time after ON injury,the result was consistent with the result of TXN mRNA level 大鼠視神經(jīng)夾傷后不同時間段TXN的表達變化。A:TXN mRNA的改變，結(jié)果顯示隨著視神經(jīng)夾傷后時間的延長，TXN mRNA下降更顯著；B:TXN mRNA結(jié)果的柱狀圖分析；C:TXN蛋白水平的改變，與TXN mRNA結(jié)果一致

Figure 2 Expression of TXN increased when RGC-5 cells were induced to form neurite outgrowth by TSA.A:TSA changed the morphology of RGC-5 cells,which formed the neuron appearance with axon formation;B:TXN mRNA level increased when RGC-5 cells was induced by TSA;C:Histogram analysis of TXN mRNA level of;D:TXN protein level increased when RGC-5 cells was induced by TSA;E:TXN mRNA level increased when RGC-5 induced by TSA at different time TSA誘導(dǎo)RGC-5細胞產(chǎn)生神經(jīng)軸突類似結(jié)構(gòu)，TXN表達顯著增加。A:TSA誘導(dǎo)RGC-5細胞形態(tài)改變，誘導(dǎo)后RGC-5細胞形態(tài)呈現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)，且有軸突產(chǎn)生；B:TSA誘導(dǎo)RGC-5細胞TXN mRNA表達水平增加；C:TXN mRNA結(jié)果的柱狀圖分析；D:在TSA誘導(dǎo)條件下，TXN蛋白水平顯著增加；E:TSA誘導(dǎo)不同時間后RGC-5細胞TXN mRNA表達變化

2.3TXN保護TNF-α誘導(dǎo)的軸突損傷為了驗證TXN是否能保護軸突免受TNF-α誘導(dǎo)的損傷，我們在RGC-5細胞中轉(zhuǎn)染p3xFLAG-CMV-7.1-TXN質(zhì)粒，過表達TXN蛋白，對照組轉(zhuǎn)染空載體，通過Western blot檢測該質(zhì)粒過表達結(jié)果見圖3。轉(zhuǎn)染12 h后，用500 nmol·L-1的TSA誘導(dǎo)RGC-5細胞24 h，再用0.5 μg的TNF-α刺激細胞4 h，統(tǒng)計產(chǎn)生軸突的細胞比例以及軸突的長度，結(jié)果見表1。

Figure 3 Over-expression of TXN protein in RGC-5 RGC-5細胞TXN蛋白過表達情況

表1 TXN過表達時RGC-5細胞軸突形成比例以及軸突長度Table 1 Proportion and length of axon with over-expression of TXN in RGC-5 cells(±s)

3 討論

引起視功能損害或喪失的主要原因可歸為3類:屈光性、血管性和神經(jīng)性。其中神經(jīng)性損害包括:青光眼視神經(jīng)病變、缺血、外傷、腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變及脫髓鞘病變等引起的視神經(jīng)(尤其是指RGC)的破壞和變性。由于神經(jīng)損傷的不可逆性,視神經(jīng)損傷性疾病目前是眼科領(lǐng)域最棘手和亟待解決的問題。近年來關(guān)于視功能的研究重點就在于疾病和損傷后如何促進中樞視覺聯(lián)系的修復(fù)與再生。本研究發(fā)現(xiàn)在視神經(jīng)受損的大鼠模型中，TXN在mRNA以及蛋白水平表達顯著下降，而在RGC-5細胞的軸突形成中，TXN的表達明顯增強，同時過表達TXN能有效地抑制TNF-α誘導(dǎo)的軸突損傷，因此我們認為TXN可能參與軸突形成以及保護，該研究將為視神經(jīng)的再生提供理論依據(jù)以及可能的治療手段。

由于原代培養(yǎng)神經(jīng)元十分困難，而且不利于細胞轉(zhuǎn)染，大大限制了軸突損傷的機制研究。有研究發(fā)現(xiàn)在TSA的誘導(dǎo)下，RGC-5細胞能呈現(xiàn)出神經(jīng)元的形態(tài)，這為軸突的研究提供了一個良好的模型。應(yīng)用該細胞模型，我們能很好地證明TXN在軸突形成與損傷中的作用。

雖然我們指出TXN可能參與軸突形成以及保護，但具體的分子機制仍不清楚。細胞骨架是軸突的主要組成結(jié)構(gòu)，當眼壓升高導(dǎo)致視神經(jīng)損傷時，視神經(jīng)中的F-actin的含量明顯減少，而用藥物抑制F-actin的解聚可以有效地保護視神經(jīng)。說明F-actin的調(diào)控參與了軸突保護以及形成過程。而近年在內(nèi)皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)TXN能與微絲骨架蛋白actin相互作用[10-11]，在氧化壓力下維持微絲骨架的穩(wěn)定。并且有文獻報道TXN在大腦神經(jīng)元的軸突處有定位[12]。因此我們推測TXN定位在視神經(jīng)處，通過與actin直接相互作用，從而調(diào)控了F-actin的聚合，最終保護軸突。以后我們將通過進一步的實驗證明該假設(shè)。

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date:Jul 21,2013

Protective effects of thioredoxin on optic nerve axon damage

LIU Xiao-Wen,FU Xun-An

thioredoxin;axon formation;axon protection;optic nerve

ObjectiveTo investigate the protective effects of thioredoxin(TXN) on optic nerve (ON) crushed in rats,and provide effective treatment for the prevention of optic nerve injury.MethodsThe traumatic optic nerve model in rats were established,the normal rats acted as a control group.Respectively at 1 week,2 weeks,4 weeks after ON injury,the retina mRNA and protein from two groups were extracted.By RT-PCR and Western blot,the expression of TXN was detected.After stimulating RGC-5 with trichostatin A,the ratio and lengths of cell axons were counted and the expression of TXN was detected.Treating with DMSO acted as a control group.Under stimulation of TNF-α,the thioredoxin protein in RGC-5 cells were over-expressed and axon formation of RGC-5 cells were observed.ResultsCompared with the normal rats,TXN mRNA and protein levels were significantly decreased in ON crush model rats.At 1 week after injury,TXN expression decreased by 32%,while at 2 weeks and 4 weeks after injury,TXN expression was down by 55% and 70%,respectively,which indicated that the level of TXN decreased more with the extension of injury time.When RGC-5 cells were induced by TSA for 24 hours,(65±5)% of the cells could produce axon,whereas the control group did not detect the axon.TXN expression also increased after treating with TSA.After stimulation with TNF-α,the proportion of axon dropped to (30±4)%,axon length decreased from (100±6)μm to (74±6)μm,but over-expression of TXN in RGC-5 cells,the proportion could recover to (52±7)% and the axon length could recover to (92±8)μm.ConclusionAfter ON injury,TXN expression is significantly decreased.In the axon formation process,the expression of TXN increases significantly.Over-expression of TXN can inhibit axonal injury induced by external stimuli.These results indicate that TXN is involved in axon formation and can effectively protect the axons from injury.

劉曉文，女，1979年10月出生，湖北隨州人，博士，主治醫(yī)師。主要研究方向:青光眼和視網(wǎng)膜色素變性的分子遺傳學(xué)研究。E-mail:liuxiaowen1979@126.com

AboutLIUXiao-Wen:Female,born in October,1979.Doctor degree.Attending doctor.E-mail:liuxiaowen1979@126.com

2013-07-21

430014 湖北省武漢市，武漢市中心醫(yī)院眼科

付汛安，E-mail:fxayanke@sina.com

劉曉文，付汛安．硫氧還蛋白TXN對視神經(jīng)軸突損傷的保護作用[J]．眼科新進展，2014，34(7)：636?639．

10．13389/j．cnki．rao．2014．0174

【實驗研究】

修回日期:2013-12-20

本文編輯:董建軍

Accepteddate:Dec 20,2013

From theDepartmentofOphthalmology,WuhanCentralHospital,Wuhan430014,HubeiProvince,China

Responsibleauthor:FU Xun-An,E-mail:fxayanke@sina.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(7):636-639]