響應(yīng)面法優(yōu)化杏汁的微波殺菌工藝研究

嚴(yán)雅慧，黃文書，白羽嘉，馮作山

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

杏屬薔薇科，又名甜梅、杏子[1]。杏果中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如多酚、多糖、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)元素等[2]。杏是新疆的主栽果樹之一，其栽培面積和產(chǎn)量均居全國各?。▍^(qū)）之首[3]，據(jù)2012年新疆統(tǒng)計(jì)年鑒[4]，杏果實(shí)產(chǎn)量為173.34萬噸，占新疆水果總量的23.53%。杏汁就是新鮮杏果實(shí)經(jīng)過挑選、清洗，榨出的汁液，是水果中最有營養(yǎng)價(jià)值的部分，其色澤艷麗、香味馥郁，甜味適度，新鮮爽口，容易被人體吸收，在風(fēng)味和營養(yǎng)上接近于新鮮杏果。

熱殺菌一直是杏汁加工的傳統(tǒng)殺菌方法，其殺菌溫度一般在90℃[5]以上，高溫處理導(dǎo)致杏汁變味、變色及營養(yǎng)成分損失[6]。微波作為一種新的殺菌方式也開始應(yīng)用于液態(tài)食品中，不僅具有低溫、短時(shí)的特點(diǎn)[7]，還對食品營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)有更多的保留，同時(shí)對鈍化酶和殺滅微生物也有較好的效果。

微波殺菌技術(shù)已廣泛應(yīng)用，一般具有以下特點(diǎn)：微波殺菌終止溫度大多是85～158℃[8]；微波殺菌的起始溫度是常溫[9-10]；采用一次微波殺菌處理。與傳統(tǒng)微波殺菌方法相比，本文的創(chuàng)新點(diǎn)是以杏汁為原料，控制杏汁微波終止溫度不超過75℃，也同時(shí)降低杏汁微波殺菌的起始溫度，再多次進(jìn)行冷凍和微波交替處理，并選用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終得到杏汁微波殺菌的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

輪臺(tái)小白杏 新疆烏魯木齊市北園春市場；平板計(jì)數(shù)瓊脂 北京奧博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無菌生理鹽水 濃度0.8%NaCl水溶液。

WD900B型微波爐 順德市格蘭仕電器實(shí)業(yè)有限公司；偉豐WF-A3000型榨汁機(jī) 永康市天歌電器有限公司；FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NCJJ-0.1/100型納米超高壓均質(zhì)機(jī) 廊坊通用機(jī)械有限公司；JM-L880型膠體磨 溫州市七星乳品設(shè)備廠；HF-D88型封杯機(jī) 浙江省瑞安市宏福包裝機(jī)械廠；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái) 上海鴻都電子科技有限公司；電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；LHS-150SC型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 杏汁的制備 杏→挑選→清洗→去核→榨汁→膠體磨→納米均質(zhì)機(jī)→調(diào)pH→封裝。

1.2.2 殺菌處理流程 研究微波殺菌處理對杏汁的影響。將100mL的杏汁置于260mL的塑料封杯中，用封杯機(jī)封口，再放在頻率為2450MHz、額定功率為900W的家用微波爐的托盤正中央，微波處理一定時(shí)間，取出立即用溫度計(jì)測量，控制杯內(nèi)杏汁的微波終止溫度最高溫度不超過75℃。一次微波處理完后，杏汁置于冰柜中冷卻至設(shè)定的起始溫度后，再進(jìn)行下一次的微波處理。

1.2.3 微生物菌落總數(shù)的測定 按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-菌落總數(shù)測定》[11]，采用平板傾注計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落總數(shù)的測定，以無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋微波處理前后和未處理作為對照的杏汁，于平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上在37℃培養(yǎng)48h，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

根據(jù)GB 19297-2003果、蔬汁飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[12]中的微生物指標(biāo)規(guī)定中，限定菌落總數(shù)（CFU/mL）≤100個(gè)，大腸菌群（MPN/100mL）≤3個(gè)，霉菌（CFU/mL）≤20個(gè)，酵母菌（CFU/mL）≤20個(gè)，致病菌都不得檢出。致死率計(jì)算公式[13]：

式中，N0-冷凍處理后1mL杏汁中活菌數(shù)；N-微波處理后1mL杏汁中活菌數(shù)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 杏汁的微波起始溫度對細(xì)菌致死率的影響

用0.3%檸檬酸將已制備好的杏汁pH調(diào)至3.5，微波次數(shù)為3次，杏汁的微波終止溫度為55℃，考慮到冷凍會(huì)使微生物的細(xì)胞大量脫水，導(dǎo)致蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生不可逆變性，還會(huì)在微生物細(xì)胞內(nèi)形成冰晶體，對細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械破壞作用，從而導(dǎo)致微生物死亡的作用，故考察杏汁的微波起始溫度降到零下，分別為-20、-10、0、10、20℃時(shí)對細(xì)菌致死率的影響，微波殺菌每一次的溫度都要重新降至起始溫度。

1.2.4.2 pH對細(xì)菌致死率的影響 將已制備好的杏汁的微波起始溫度設(shè)為-10℃，微波次數(shù)為3次，杏汁的微波終止溫度為55℃，考察pH分別為3、3.5、4、4.5、5時(shí)對細(xì)菌的致死率的影響，微波殺菌每一次的溫度都要重新降至起始溫度。

1.2.4.3 微波次數(shù)對細(xì)菌致死率的影響 用0.3%檸檬酸將已制備好杏汁pH調(diào)至3.5，杏汁的微波起始溫度設(shè)為-10℃，杏汁的微波終止溫度為55℃，考察微波次數(shù)分別為1、2、3、4、5、6次時(shí)對細(xì)菌的致死率的影響，微波殺菌每一次的溫度都要重新降至起始溫度。

1.2.4.4 杏汁的微波終止溫度對細(xì)菌致死率的影響

用0.3%檸檬酸將已制備好杏汁pH調(diào)至3.5，杏汁的微波起始溫度設(shè)為-10℃，微波次數(shù)為3次，考察杏汁的微波終止溫度分別為35、45、55、65、75℃時(shí)對細(xì)菌致死率影響，微波殺菌每一次的溫度都要重新降至起始溫度。

1.2.5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以微波殺菌的細(xì)菌的致死率（Y%）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，確定最優(yōu)微波殺菌工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)因素編碼表如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素水平及編碼Table 1 Corresponding actual values of variables and coded values in response surface design

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式給出。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 杏汁的微波起始溫度對細(xì)菌致死率的影響 杏汁的微波起始溫度對細(xì)菌致死率的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 微波起始溫度對細(xì)菌致死率的影響Fig.1 Effect of starting temperature of microwave on bacterial mortality rate

由圖1可知，在杏汁的微波起始溫度為-20～-10℃范圍內(nèi)，細(xì)菌致死率隨著杏汁微波起始溫度的升高而增大，-10℃時(shí)達(dá)到最大，隨后又減小?？赡苁且?yàn)樾又?20～0℃冷凍過程中，冰晶體的形成不僅使微生物細(xì)胞遭到機(jī)械性破壞，使微生物細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)或膠體脫水，最后導(dǎo)致不可逆的蛋白質(zhì)變性[14]，使得微生物的存活率迅速下降，從而增強(qiáng)了微波輻射處理對杏汁中微生物的殺滅能力。同時(shí)，微波非熱殺菌效應(yīng)與介質(zhì)獲取的微波能量有密切關(guān)系，在微波發(fā)生器輸出能量恒定的條件，微波處理時(shí)間越長，介質(zhì)獲得的微波輻射能量越多，產(chǎn)生的殺菌效果就越好[15]，把杏汁的起始溫度降到零下，可擴(kuò)寬杏汁升溫空間，延長杏汁的微波處理時(shí)間，使杏汁在低的殺菌溫度下反復(fù)多次獲得更多的微波輻射能，從而增強(qiáng)對微生物的殺傷作用。當(dāng)微波起始溫度0～20℃時(shí)，由于冷凍作用消失，微波終止溫度不高，使得杏汁的微波處理時(shí)間縮短，獲得的微波輻射能減少，所以致死率大幅度降低。

2.1.2 pH對細(xì)菌致死率的影響 pH對細(xì)菌致死率的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH對細(xì)菌致死率的影響Fig.2 Effect of pH on bacterial mortality rate

由圖2可知，隨著pH的增加，細(xì)菌致死率呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢。微生物通常可以在一個(gè)較寬的pH范圍內(nèi)生長，但都有一個(gè)最適pH，但隨著環(huán)境pH的不斷變化，使得微生物繼續(xù)生長受阻，當(dāng)超過最低或最高pH時(shí)微生物就死亡[16]。在pH3.5時(shí)，微波殺菌效果最好，推測可能由于杏汁中大部分微生物的最適pH＞3.5，超出微生物生長的pH范圍，使維持細(xì)胞內(nèi)外pH動(dòng)態(tài)平衡的氫離子泵功能受到嚴(yán)重破壞，影響細(xì)胞產(chǎn)能過程，細(xì)胞耗能得不到及時(shí)補(bǔ)充而致死[17]。

2.1.3 微波次數(shù)對細(xì)菌致死率的影響 微波次數(shù)對細(xì)菌致死率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 微波次數(shù)對細(xì)菌致死率的影響Fig.3 Effect of microwave times on bacterial mortality rate

從圖3能看出，當(dāng)微波次數(shù)1～3次，隨著微波次數(shù)的增加，細(xì)菌致死率也隨之增加，當(dāng)微波次數(shù)超過3次后，致死率無明顯變化，可能是1～3次微波輻射處理，殺滅了杏汁中大部分由于反復(fù)冷凍使得細(xì)胞遭到機(jī)械破壞以及pH3.5已經(jīng)超出能生長范圍的微生物，超過3次后，有可能是因?yàn)榘褜ξ⒉ㄝ椛涿舾械拇蟛糠治⑸锒細(xì)⑺?，之后殘存的微生物對微波輻射不敏感?/p>

2.1.4 微波終止溫度對細(xì)菌致死率的影響 微波終止溫度對細(xì)菌致死率的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 微波終止溫度對細(xì)菌致死率的影響Fig.4 Effect of terminating temperature of microwave on bacterial mortality rate

由圖4可知，隨著杏汁微波終止溫度的升高，細(xì)菌致死率增加，當(dāng)杏汁的微波終止溫度到65℃時(shí)，細(xì)菌致死率達(dá)到最大，超過65℃后，細(xì)菌致死率的升高幅度開始平緩。分析原因可能是微生物細(xì)胞在微波輻射場的作用下，其分子也被極化并作高頻振蕩，產(chǎn)生熱效應(yīng)，溫度的快速升高使微生物蛋白質(zhì)等生物大分子變性失活，細(xì)菌代謝異常，使菌體死亡或受到嚴(yán)重干擾而無法繁殖[18-19]，但超過65℃后，微波處理把大部分對電磁輻射敏感的微生物都?xì)?，殘存的是對輻射有一定耐受力的?xì)菌，所以75℃的細(xì)菌致死率與65℃相比無明顯變化。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化微波殺菌條件的結(jié)果分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Design-Expert 8.0.6軟件統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用四因素三水平的Box-Behnken組合設(shè)計(jì)進(jìn)行微波殺菌工藝的優(yōu)化研究，選擇微波起始溫度、pH、微波次數(shù)與微波終止溫度為自變量，以微波作用于細(xì)菌的致死率（Y%）作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果如表2所示。

2.3 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

用軟件Design Expert 8.0.6對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，選擇對響應(yīng)值影響顯著的各項(xiàng)，可得杏汁的微波起始溫度、pH、杏汁的微波終止溫度、微波次數(shù)與細(xì)菌致死率的多項(xiàng)回歸方程，回歸方程為：

對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)、方差分析及各因素最佳值分析，結(jié)果見表3。

F檢驗(yàn)反映的是回歸模型的有效性，包括失擬項(xiàng)檢驗(yàn)和回歸方程顯著性檢驗(yàn)。由方差分析表3可見，該模型p＜0.0001，表明該模型極顯著；失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著（p=0.1689＞0.05）。方程模擬的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9922，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.9843，說明建立的模型能理解響應(yīng)值變化的98.43%，表明此模型擬合度較好，回歸方程能很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，該實(shí)驗(yàn)方法可靠。

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型的一次項(xiàng)X1、X3和X4（p＜0.01）影響極顯著，X2（p＞0.05）影響不顯著；二次項(xiàng)（p＜0.01）影響均極顯著；交互項(xiàng)X1X4（p＜0.01）影響極顯著，X1X2、X1X3、X2X3、X2X4、X3X4影響都不顯著。對一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對值大小進(jìn)行比較可知，影響微波殺菌過程的因素作用大小為：X3＞X1＞X4＞X2，即杏汁的微波終止溫度＞杏汁的微波起始溫度＞微波次數(shù)＞pH。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

用Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化，分析得到微波殺菌的最佳工藝條件為：pH3.50，微波次數(shù)3.20，微波起始溫度為-10.87℃，微波終止溫度為67.02℃，此條件下細(xì)菌的致死率理論可達(dá)99.5644%。

2.4 因素間的交互作用

采用Design Expert 8.06軟件分析并繪制相應(yīng)的響應(yīng)面圖，如圖5～圖10所示。

圖5～圖10直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響，比較6個(gè)圖可知：微波終止溫度（X3）對細(xì)菌致死率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線相對較陡；其次為微波起始溫度（X1），微波次數(shù)（X4）、pH（X2）表現(xiàn)為曲線相對較為平滑，隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與真實(shí)情況的一致性，對上述優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：pH3.5、微波次數(shù)為3次、微波終止溫度為67℃、微波起始溫度為-11℃。杏汁的原始細(xì)菌總數(shù)為9400CFU/mL，在修正后的工藝條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到殘存的細(xì)菌總數(shù)5個(gè)/CFU/mL，酵母菌3個(gè)/CFU/mL，大腸菌群、霉菌和致病菌都無檢出，即微波對細(xì)菌的致死率是99.68%，比理論預(yù)測值99.5644%效果還好。因此，經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化所得的微波殺菌最佳工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model equation

圖5 微波起始溫度與pH對細(xì)菌致死率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.5 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of microwave starting temperature and pH

圖6 微波起始溫度與微波終止溫度對細(xì)菌致死率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.6 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of microwave starting temperature and microwave terminating temperature

圖7 微波起始溫度與微波次數(shù)對細(xì)菌致死率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.7 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of microwave starting temperature and microwave times

圖8 pH與微波終止溫度對細(xì)菌致死率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.8 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of pH and microwave terminating temperature

圖9 pH與微波次數(shù)對細(xì)菌致死率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.9 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of pH and microwave times

3 結(jié)論與討論

圖10 微波終止溫度與微波次數(shù)對細(xì)菌致死率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.10 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of microwave terminating temperature and microwave times

本實(shí)驗(yàn)通過單因素和Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，建立了模型，預(yù)測了微波的最佳殺菌條件：pH為3.5、微波次數(shù)為3次、微波終止溫度為67℃、微波起始溫度為-11℃。

在此條件下的杏汁微波殺菌工藝，微波輻射對細(xì)菌的致死率可達(dá)到99.68%，使得原始細(xì)菌總數(shù)為9400CFU/mL的杏汁經(jīng)過微波殺菌工藝后，殘余細(xì)菌總數(shù)5個(gè)/CFU/mL，酵母菌3個(gè)/CFU/mL，大腸菌群、霉菌和致病菌都無檢出，得到殺菌后的杏汁不僅符合GB 19297-2003果、蔬汁飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，又由于微波處理杏汁的溫度低，時(shí)間短，還能很好地保持杏汁原有的色澤、風(fēng)味、營養(yǎng)和功效成分，所以該方法殺菌效果好，可用于生產(chǎn)高品質(zhì)的杏汁產(chǎn)品。

本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造性地利用冷凍和微波的交替處理，有效殺滅杏汁中的各類酶活性和絕大多數(shù)微生物，達(dá)到商業(yè)無菌的要求，并且本實(shí)驗(yàn)中選用的響應(yīng)值-細(xì)菌致死率（Y%），已經(jīng)消除了冷凍對微生物的作用，更能精確的反映微波殺菌對微生物的影響。

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