脅迫時間和脅迫濃度對超積累植物印度芥菜細(xì)胞中鎘分布的影響

楊紅霞， 張惠娟， 高津旭， 劉 崴， 李 冰

(1.國家地質(zhì)實驗測試中心， 北京 100037； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 江蘇 南京 230026)

脅迫時間和脅迫濃度對超積累植物印度芥菜細(xì)胞中鎘分布的影響

楊紅霞1， 張惠娟2， 高津旭1， 劉 崴1， 李 冰1

(1.國家地質(zhì)實驗測試中心， 北京 100037； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 江蘇 南京 230026)

超積累植物對重金屬的區(qū)隔化作用能有效降低細(xì)胞質(zhì)內(nèi)金屬離子的濃度，是對重金屬重要的解毒機(jī)制之一，而細(xì)胞內(nèi)各組織的區(qū)隔化作用大小并未取得一致性結(jié)論。本文研究了脅迫濃度和脅迫時間對超積累植物印度芥菜(Brassicajuncea)細(xì)胞及亞細(xì)胞中鎘分布的影響。印度芥菜幼苗分別用0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L鎘脅迫1、5、7、10、14天后收獲，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定印度芥菜根系和葉片亞細(xì)胞中鎘的含量。結(jié)果表明：鎘在細(xì)胞壁中的比例占50%～64%，細(xì)胞液占22%～38%，細(xì)胞器占7%～17%，鎘在細(xì)胞壁中所占比例顯著高于細(xì)胞液和細(xì)胞器，證明細(xì)胞壁區(qū)隔化在鎘的解毒機(jī)制中具有重要的作用。隨著脅迫時間和脅迫濃度的增加，根系和葉片中亞細(xì)胞各組織中鎘含量持續(xù)增加，超過7天，鎘含量顯著升高，說明鎘對植物的危害是一個緩慢過程。印度芥菜對鎘脅迫濃度的最大耐受量為1.0 mg/L，超過此濃度，植物細(xì)胞的破壞癥狀加重；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)研究也表明，鎘脅迫濃度超過1.0 mg/L后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的損壞，出現(xiàn)質(zhì)壁分離、液泡增大甚至空泡化、質(zhì)膜粗糙等現(xiàn)象，繼而影響到細(xì)胞的正常功能。因此，在考察重金屬對植物的危害時，要充分考慮時間和濃度梯度兩個參數(shù)的協(xié)同作用。

鎘； 亞細(xì)胞； 脅迫時間； 脅迫濃度； 電感耦合等離子體質(zhì)譜法； 掃描透射電鏡

近年來，研究重金屬在植物細(xì)胞中的微區(qū)分布漸漸成為探索植物耐性機(jī)理的熱點，一方面有利于在細(xì)胞水平上揭示重金屬毒害植物機(jī)理，在重金屬脅迫條件下，植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)會發(fā)生不同程度的損傷，主要在細(xì)胞膜、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、葉綠體、線粒體、液泡等細(xì)胞器異常變化中體現(xiàn)出來[1]；另一方面可通過植物細(xì)胞器的損害程度來作為一種監(jiān)測手段，為以后可能將植物作為重金屬污染指示者奠定理論基礎(chǔ)。

大量研究表明，超積累植物(如印度芥菜、遏藍(lán)菜、東南景天、美洲商陸等)對鎘的區(qū)隔化作用能有效降低細(xì)胞質(zhì)內(nèi)金屬離子的濃度，是對重金屬重要的耐受機(jī)制之一[2-4]。已有的研究表明，細(xì)胞壁作為重金屬進(jìn)入植物體的第一道屏障，在植物重金屬耐受機(jī)理中的作用倍受關(guān)注[5-8]。由于細(xì)胞壁含有大量配體殘基，對金屬陽離子有高親和力，通過包括離子交換、吸附、配位絡(luò)合等作用結(jié)合重金屬，進(jìn)而影響重金屬離子向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散速率及吸收，以達(dá)到解毒的作用[9]。而液泡里富含各種蛋白質(zhì)、糖、有機(jī)酸和有機(jī)堿等，都能與重金屬結(jié)合耐受，常被認(rèn)為是重金屬離子貯存的主要場所[10-11]。通常采用掃描透射電鏡(SEM)觀察植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，反映重金屬對植物細(xì)胞的危害程度。不同的研究者對戊二醛、鋨酸采用不同的濃度，并用不同的試劑進(jìn)行逐級脫水和染色，透射電鏡掃描結(jié)果顯示，在Cd脅迫下，植物細(xì)胞形成空的液泡，膜系統(tǒng)遭損壞，細(xì)胞線粒體和葉綠體也出現(xiàn)不同程度變化，高濃度下，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12-18]。由此可見，重金屬對植物的毒害與其在植物體內(nèi)各組織中的分布有關(guān)。同時，不同植物對鎘的耐受程度也不同，脅迫時間和脅迫濃度是研究重金屬毒害效應(yīng)的兩個重要參數(shù)。

本研究選取印度芥菜(BrassicaJuncea)為研究對象，進(jìn)行室內(nèi)植物培養(yǎng)，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)對印度芥菜根系和葉片細(xì)胞不同部位中的鎘含量進(jìn)行了測定，初步探討了脅迫時間和脅迫濃度對鎘在細(xì)胞中分布的影響。并借助掃描透射電鏡技術(shù)觀察了不同鎘脅迫濃度下，根系和葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，為進(jìn)一步研究重金屬對植物的毒害機(jī)理提供依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 儀器及主要試劑

Agilent 7500a電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Agilent 公司)。工作參數(shù)：射頻功率1350 W；采樣深度5.7 mm；霧化器類型Babinton型；載氣流速1.10 L/min。

透射電鏡型號為TEM-1200EX(日本JEOL公司)。

鎘標(biāo)準(zhǔn)儲備液：1.0 mL/mg Cd。準(zhǔn)確稱取高純0.1142 g氧化鎘于燒杯中，加入50%的硝酸20 mL，加熱溶解。冷卻后移入100 mL 容量瓶中。以水定容，搖勻。使用時按需要逐級稀釋。

實驗中所用的硝酸、高氯酸、磷酸、鋨酸、檸檬酸、醋酸均為優(yōu)級純試劑。

水：去離子水再經(jīng)Milli-Q裝置純化(>18 MΩ·cm)。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品制備全部用Milli-Q純化水。

1.2 植物培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[19-20]的方法，選取積累型印度芥菜種子在培養(yǎng)箱中進(jìn)行植物預(yù)培養(yǎng)。植株長成后分別用0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L鎘脅迫1、5、7、10、14天。處理溶液的pH=5.8。

1.3 細(xì)胞分離

采用Wang等[21]建立的方法處理樣品。稱取適量植物根系或葉片，與10 mL預(yù)冷的提取液(內(nèi)含 pH=7.5的50 mmol/L Tris-HCl、250 μmol/L蔗糖及1.0 mmol/L二硫代蘇糖醇混合后加入少量液氮研磨成勻漿。勻漿于超高速冷凍離心機(jī)(Sigma 3K30)在3000 r/min下離心15 min，所得沉淀物即為細(xì)胞壁組分，其主要成分為細(xì)胞壁及其殘渣。上清液在15000 r/min下離心30 min，最后所得上清液為細(xì)胞液(主要為液泡部分)及沉淀物(細(xì)胞器部分，主要為線粒體、葉綠體等)。整個過程全部在4℃條件下操作。分離后的各部分提取物用3～5 mL硝酸-高氯酸(體積比4∶1)消解后，用2%的硝酸定容至10mL，然后用ICP-MS測定Cd含量。

1.4 透射電鏡切片處理

取1～3mm根尖，葉片取從頂部往下第5片葉子去葉柄并切成約1mm×1mm大小，包埋在2.5%的戊二醛溶液中，4℃固定過夜，然后按下列步驟處理樣品：倒掉固定液，用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH=7.0)漂洗樣品三次，每次15min；用1%的鋨酸溶液固定樣品1～2h；倒掉固定液，再用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH=7.0)漂洗樣品三次，每次15min；之后用5種梯度濃度(50%、70%、80%、90%和95%)的乙醇溶液對樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15min，再用100%的乙醇處理一次，每次20min；最后過渡到純丙酮處理20min；用包埋劑(2.5%戊二醛)與丙酮的混合液(體積比1∶1)浸泡1h；用包埋劑與丙酮的混合液(體積比3∶1)浸泡3h；純包埋劑處理樣品過夜；將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋起來，70℃加熱過夜，即得到包埋好的樣品。樣品在Reichert超薄切片機(jī)中切片，獲得70～90nm的切片，該切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾-50%乙醇飽和溶液各染色15min，電鏡觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 脅迫時間和脅迫濃度對亞細(xì)胞中鎘分布的影響

為了研究鎘在根系和葉片亞細(xì)胞各組織中的分布，考察脅迫時間和脅迫濃度對亞細(xì)胞各組織的區(qū)隔化作用大小的影響，印度芥菜分別用0.5、1.0、3.0、5.0、10.0mg/LCd標(biāo)準(zhǔn)溶液脅迫1、5、7、10、14天后收割，進(jìn)行亞細(xì)胞組織分離后，觀察亞細(xì)胞各組織中Cd的分布比例。隨著脅迫時間的變化，各組織中Cd的含量差別不大，但隨著脅迫濃度的變化，根系和葉片中Cd的含量都有變化。以刺激時間1天為例，結(jié)果見圖1，隨著脅迫濃度的增加，鎘含量在根系細(xì)胞壁中占50%～62%，細(xì)胞液占22%～32%，細(xì)胞器占10%～17%。而在葉片中，鎘含量在細(xì)胞壁中53%～64%，細(xì)胞液占27%～38%，細(xì)胞器占6.9%～9.0%，可以看出，鎘含量在根系和葉片的細(xì)胞壁中所占比例顯著高于細(xì)胞液和細(xì)胞器，隨著脅迫濃度的增加，在細(xì)胞器中的比例反而降低，減少了對細(xì)胞的毒害。

本研究結(jié)果表明細(xì)胞壁作為重金屬進(jìn)入植物體的第一道屏障，在植物重金屬耐受機(jī)制中起重要作用。而細(xì)胞壁對金屬的固定作用不是一個普遍的抗金屬毒害的機(jī)制。例如抗Zn毒和Zn敏感型菜豆的細(xì)胞壁物質(zhì)表現(xiàn)出相似的親和力[22]，而在對黃瓜、菠菜為材料研究發(fā)現(xiàn)，Cd在細(xì)胞壁上結(jié)合的量較少，而主要與細(xì)胞內(nèi)成分結(jié)合[23]。因而細(xì)胞壁在超積累植物起多大作用，有待于進(jìn)一步研究。

2.2 脅迫時間和脅迫濃度對亞細(xì)胞中鎘含量的影響

脅迫時間(1、5、7、10、14天)和脅迫濃度(0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0mg/L)對亞細(xì)胞中Cd含量的影響如圖2所示?？傮w上看，根系和葉片的亞細(xì)胞中鎘含量與脅迫濃度和時間成正相關(guān)，隨著脅迫時間和濃度的增大，根系和葉片亞細(xì)胞組織中鎘含量增大，根系的亞細(xì)胞中鎘含量遠(yuǎn)大于葉片亞細(xì)胞。說明Cd在植物體內(nèi)的傳輸過程是由根至莖，再至葉。

圖 1 脅迫濃度對細(xì)胞不同組織中鎘分布的影響

Fig.1Effectofexposureconcentrationoncadmiumdistributionindifferenttissuesofcells

圖 2 不同鎘刺激濃度和時間下根系和葉片細(xì)胞中鎘含量分布規(guī)律

Fig.2Subcellulardistributionofcadmiuminrootandleafsamples

圖 3 不同鎘濃度下印度芥菜根系的顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 SEM maps of subcelluar under different cadmium disposal in root samplesChl—葉綠體；CP—細(xì)胞質(zhì)；V—液泡；CW—細(xì)胞壁；M—線粒體；PM—細(xì)胞質(zhì)膜；SG—淀粉粒；OG—嗜鋨顆粒；N—細(xì)胞核。

脅迫時間和脅迫濃度對亞細(xì)胞中Cd含量的影響如下：脅迫時間低于7天時，亞細(xì)胞中鎘含量緩慢上升;超過7天，亞細(xì)胞中鎘含量顯著升高，說明鎘對植物的危害是一個緩慢過程。而且脅迫濃度低于1.0mg/L時，根和葉片的亞細(xì)胞中鎘含量相差不大，結(jié)合植物生物量在1.0mg/L時最大的結(jié)果，推斷植物對Cd的最大耐受量為1.0mg/L，超過此濃度植物的正常生長將受到影響[16]。

2.3 脅迫濃度對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖 4 不同鎘濃度下印度芥菜葉片的顯微結(jié)構(gòu)Fig.4 SEM maps of subcelluar under different cadmium disposal in leaf samples

為了研究鎘脅迫濃度對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，對根和葉片用透射電鏡分析，結(jié)果見圖3和圖4。圖3結(jié)果表明，對照組(脅迫濃度0mg/L)印度芥菜根細(xì)胞的細(xì)胞器沒有明顯的損傷，植物細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞壁表面光滑、清晰、連續(xù)，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器豐富并基本充滿整個細(xì)胞。不同濃度鎘處理后，相比于對照組均出現(xiàn)了不同程度的結(jié)構(gòu)破壞癥狀，隨著脅迫濃度的增加，細(xì)胞破壞癥狀加重。1mg/L鎘溶液處理后，根細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)明顯減少，細(xì)胞出現(xiàn)空泡化。5mg/L鎘溶液處理后，癥狀進(jìn)一步加重，并且發(fā)生了嚴(yán)重的質(zhì)壁分離，質(zhì)膜變得粗糙，出現(xiàn)許多沉積物。

圖4結(jié)果表明，在未經(jīng)Cd處理的對照組(脅迫濃度0mg/L)葉片樣品中，細(xì)胞完整，葉綠體片層結(jié)構(gòu)清晰，葉綠體呈橢圓形并有著規(guī)則的類囊體膜(對照)。Cd處理以后，印度芥菜葉片細(xì)胞出現(xiàn)了一些結(jié)構(gòu)變化。1mg/L鎘處理時，細(xì)胞結(jié)構(gòu)有輕微的變化，到5mg/L鎘處理時，開始出現(xiàn)質(zhì)壁分離，液泡增大，葉綠體略微腫脹，基粒減少，片層結(jié)構(gòu)松散，并且出現(xiàn)了一些嗜鋨顆粒。隨著鎘脅迫濃度的增加，葉片細(xì)胞破壞癥狀表現(xiàn)與根系細(xì)胞類似。

3 結(jié)語

本文研究不同鎘脅迫時間和脅迫濃度條件下鎘在亞細(xì)胞中的分布比例和規(guī)律，結(jié)果表明隨著脅迫時間的變化，各組織中Cd的含量變化不大；隨著脅迫濃度增加，鎘在根系和葉片細(xì)胞壁中所占比例顯著高于細(xì)胞液及細(xì)胞器，而隨著脅迫濃度的增加，鎘在細(xì)胞器中的比例有所降低，減少了對細(xì)胞的毒害。說明細(xì)胞壁作為重金屬進(jìn)入植物體的第一道屏障，在植物重金屬耐受機(jī)制中起重要作用。

脅迫時間和脅迫濃度對植物亞細(xì)胞中鎘含量的影響說明鎘對植物的危害是一個緩慢過程。超微結(jié)構(gòu)研究也表明，鎘脅迫濃度超過1mg/L后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的損壞；隨著脅迫濃度的增加，細(xì)胞破壞癥狀加重。由此，在考察重金屬對植物的危害時，要充分考慮時間和濃度梯度兩個參數(shù)。重金屬的亞細(xì)胞水平相關(guān)研究的深入，可望為揭示超積累植物中重金屬的區(qū)隔化作用進(jìn)一步提供理論參考。然而由于實驗條件的限制，對于這些重金屬如何進(jìn)入相應(yīng)組織(細(xì)胞)以獲得區(qū)隔或解毒作用仍缺乏了解。

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Effect of Exposure Levels and Exposure Time on Subcellular Distribution of Cadmium in Indian Mustard (Brassicajuncea)

YANGHong-xia1,ZHANGHui-juan2,GAOJin-xu1,LIUWei1,LIBing1

(1.National Research Center for Geoanalysis, Beijing 100037, China; 2.College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agriculture University, Nanjing 230026, China)

Segmentation effect of super accumulation of heavy metals in plants which can reduce the concentration of metal ions in the cytoplasm of a cell is one of the important mechanisms of heavy metal detoxification. However, the compartmentalization effect from different tissues of a cell does not get a consistent conclusion. In order to evaluate whether intracellular compartmentalization could explain Cd detoxification mechanisms, the work described in this paper was designed to study the effect of exposure time and levels on Cd distribution of Indian mustard (Brassicajuncea) at the cell and sub-cell level. Root and leaf samples were exposed to 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 and 5.0 mg/L and harvested after 1, 5, 7, 10 and 14 days exposure. Cells were separated into three fractions: cytoderm, soluble fraction and organelle containing fraction using differential centrifugation technique, then Cr from all three fractions was determined by Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry (ICP-MS). Results showed that Cr in cytoderm, cytoplasm and organelles accounted for 50%-64%, 22%-38% and 7%-17% of total cadmium, respectively. It can be clearly indicated that the proportion of Cr in cytoderm is significantly higher than that in cytoplasm and organelles, indicating that compartmentalization of cytoderm plays a prominent role in Cd detoxification. As the exposure concentration and time increases, the content of Cd in cell fraction increases significantly especially after 7 days, which demonstrates that the effect of Cd on plant development is a slow process. Moreover, the excess of Cr stress concentration (>1.0 mg/L) would lead to deteriorative damage on plant cells, which was visually identified by TEM research, demonstrating different degrees of damages-plasmolysis, vacuolization and plasmalemma roughness, thus affecting the normal function of cells. These results suggest exposure time and levels are important parameters that must be taken into consideration in the study of the toxicity of heavy metals in plants.

cadmium; subcellular distribution; exposture time; exposure levels; Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry; Scanning Transmission Electron Microscopy

2013-10-08；

2014-02-21； 接受日期： 2014-06-04

國土資源部公益性行業(yè)科研專項(200911043-26)；中國地質(zhì)大調(diào)查項目(12120113015400)

楊紅霞，副研究員，博士，地球化學(xué)專業(yè)。E-mail： yanghongxia1@sina.com。

0254-5357(2014)05-0723-07

O614.242; O657.63; P575.2

A